[發明專利]一種評價皮膚刺激性的方法、裝置及其應用

有效

• 申請號: 201610406817.8
• 申請日: 2016-06-12
• 公開（公告）號: CN105954277B
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 湯清涵;江雯怡;沈菁菁;何毓婕;陳軍;張會;馬敏;顧薇
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N1/28;G01N1/42
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

本發明涉及外用藥物制劑及化妝品領域，特別是涉及一種評價皮膚刺激性的方法、裝置及其應用，可以有效替代目前的動物試驗方法。

背景技術

在藥物制劑領域，經皮給藥由于其方便性，越來越受到重視；在化妝品領域，由于人們對生活質量的要求提高，其市場不斷擴大，據估算，我國的外用藥物制劑與化妝品的市場規模達到3000億元/年。根據國家食藥監總局頒布的《化妝品安全技術規范》、《藥物非臨床研究質量管理規范》等相關文件的規定，為了保證安全性，以上產品均需要開展皮膚刺激性評價。

目前常用的皮膚刺激性評價方法主要是借助于動物實驗，將動物的部分皮膚暴露，分別涂抹受試產品和對照產品，通過觀察皮膚的反應（如是否出現紅腫、炎癥等）進行評分，或通過處死動物取皮膚做病理切片檢查進行評價。這種方法存在以下問題：第一，成本較高，以常用的動物兔子為例，一只兔子100元左右，只能進行一次實驗，并且還存在飼養成本；第二，周期較長，動物本身有一個較長的成長周期，而且在目前的皮膚刺激性評價方法下，單次涂抹受試產品后一般需要24~72h觀察刺激性試驗結果；第三，存在一定的主觀性，目前的皮膚反應主要還是通過人為評分進行的，因此不夠客觀；第四，差異較大，動物的種屬、個體、性別、年齡的差異都會影響實驗結果，因此重現性往往不佳。此外，動物的使用也存在一定倫理學問題，2013年3月，歐盟國家宣布全面禁止銷售和進口經過動物測試的化妝品（含原料）和牙膏、肥皂等日化產品。

因此，如能采用體外裝置快速替代動物試驗快速評價皮膚刺激性，將有效地解決上述問題，無疑會為外用藥物制劑以及化妝品的質量評價提供有力的技術保障。脂質體是一種組成和結構類似于生物膜的微型載體，本研究團隊此前已經研制了用于皮膚滲透性試驗的脂質體人工皮膚膜技術并申請了專利（申請號：201510818671.3），在此基礎上，我們通過結合嵌套裝置、優化脂質體制備工藝和載入指示劑進一步研制了一種新型的評價皮膚刺激性的裝置（圖1、圖2、圖3）和方法，可以有效替代目前的動物試驗方法，用于外用藥物制劑和化妝品的皮膚刺激性的快速評價。

發明方案

發明目的：本發明要解決的技術問題是研發一種能夠代替活體動物試驗的一種簡單、快捷、可靠的皮膚刺激性試驗方法。該方法采用評價皮膚刺激性的裝置，通過接受液指示劑直觀顯色快速判斷皮膚刺激性強弱，從而顯著提高皮膚刺激性評價的效率，降低成本，并且顯著提高試驗的可控性和重現性，最終能夠替代動物試驗用于外用藥物制劑和化妝品的質量控制。

本發明提供一種評價皮膚刺激性的裝置，其包含膜嵌套裝置和脂質體人工皮膚膜；其中膜嵌套裝置由嵌套板、膜嵌套兩部分組成，膜嵌套位于嵌套板的孔中，脂質體人工皮膚膜結合在膜嵌套上；

脂質體人工皮膚膜按如下步驟制備：

（1）含有指示劑的脂質體的制備：將磷脂材料溶解于有機溶劑中，指示劑溶解在50~120份含有5~15 %乙醇的磷酸鹽緩沖液中，選擇薄膜法、注入法或逆相蒸發法制備脂質體，得到的脂質體混懸液采用高壓均質或者超聲技術減小粒徑，分別制得粒徑為150~400nm的含指示劑小粒徑脂質體和粒徑為400~800nm的含指示劑大粒徑脂質體。

其中所述磷脂材料包含重量比為1~8 : 1的卵磷脂，膽固醇；指示劑選自羅丹明B、鈣黃綠素、羧基熒光素、依文思藍或異硫氰酸熒光素；

（2）微孔濾膜與膜嵌套底部的密封：將孔徑為0.45 μm的微孔濾膜和膜嵌套底部150 ℃加熱，使微孔濾膜與嵌套底部形成完全密封的小室；

（3）脂質體與微孔濾膜的結合：將步驟（1）制備所得的1~10份粒徑為150~400nm的含指示劑小粒徑脂質體和1份粒徑為400~800nm的含指示劑大粒徑脂質體分別通過離心分層鋪于微孔濾膜膜上；

（4）凍融循環；將步驟（3）中結合脂質體后的微孔濾膜置于-70~-120 ℃冷凍0.5~1 h，取出后50~75 ℃加熱0.5~1 h，如此循環凍融2~3次，即得脂質體人工皮膚膜。

作為本發明的進一步改進，脂質體人工皮膚膜制備步驟（1）中所述磷脂材料為重量比為1~8 : 1 : 0.2 : 0.6 : 2的卵磷脂，膽固醇，膽固醇硫酸酯、神經酰胺、棕櫚酸。

作為本發明的更進一步改進，脂質體人工皮膚膜制備步驟（1）中所述指示劑為羅丹明B。