[發(fā)明專利]一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610404506.8
• 申請(qǐng)日: 2016-06-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106084114B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉秀英;朱力杰;湯軼偉;勵(lì)建榮;高雪;張德福
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 渤海大學(xué)
• 主分類號(hào): C08F220/06
• 分類號(hào): C08F220/06;C08F222/14;B01J20/26;B01J20/30;G01N21/64
• 代理公司: 錦州遼西專利事務(wù)所(普通合伙)21225
• 代理人: 王佳佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法。

背景技術(shù)

恩諾沙星，是氟喹諾酮類抑菌劑中應(yīng)用最為廣泛的品種之一，常被用于獸醫(yī)臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。但因其耐藥性和潛在的致癌性引起了廣泛的關(guān)注。目前恩諾沙星的檢測(cè)方法主要是儀器法和酶聯(lián)免疫法，然而儀器法所需儀器昂貴，操作復(fù)雜，酶聯(lián)免疫法需要抗體，抗體穩(wěn)定性差，制備周期長(zhǎng)。這兩種方法都存在一定的問(wèn)題。

適配體(Aptamer)是通過(guò)SELEX技術(shù)篩選得到的一段可以特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子的寡聚核苷酸片段(DNA或RNA)。適配體能夠與靶標(biāo)分子發(fā)生特異性結(jié)合，且親和力高、特異性強(qiáng)。與抗體相比，適配體篩選無(wú)需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)需要進(jìn)行全化學(xué)合成；篩選周期短，有效避免抗體存在批次差異大的問(wèn)題，可實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)；適配體末端易于修飾上各種活性基團(tuán)，可根據(jù)不同分析目的對(duì)其進(jìn)行固定修飾。這些優(yōu)點(diǎn)使其在分析檢測(cè)和傳感領(lǐng)域中顯示出良好的應(yīng)用前景。

分子印跡技術(shù)是模擬天然分子識(shí)別現(xiàn)象，人工合成對(duì)特定印跡分子具有高度選擇性固態(tài)高分子聚合物的新技術(shù)。因其具有選擇性高、穩(wěn)定性好、制備過(guò)程簡(jiǎn)單、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，常常被譽(yù)為“仿生抗體”，表現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力。

熒光檢測(cè)是一種常用的快速檢測(cè)方法。作為新型發(fā)光材料的上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs)發(fā)展迅速。UCNPs具有獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì)，以近紅外光作為激發(fā)光源，可有效避免樣品基質(zhì)自發(fā)熒光的干擾，熒光背景信號(hào)干擾小。該材料還具有化學(xué)穩(wěn)定性好、熒光壽命長(zhǎng)、吸收和發(fā)射帶窄、量子產(chǎn)率高以及毒性低等諸多優(yōu)點(diǎn)，是理想的熒光探針標(biāo)記物。

本發(fā)明以上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子標(biāo)記，將分子印跡聚合物與適配體的高特異性結(jié)合，制備一種可應(yīng)用于恩諾沙星識(shí)別與測(cè)定的適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提出一種對(duì)恩諾沙星同時(shí)具有富集和上轉(zhuǎn)換光信號(hào)傳感復(fù)合材料的適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案：

一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法，采用上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為載體偶聯(lián)恩諾沙星適配體，以甲基丙烯酸為功能單體，利用分子印跡技術(shù)中的包埋法制備，其制備步驟如下：

一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法，制備步驟如下：

(1)將Y₂O₃、Yb₂O₃和Tm₂O₃硝酸化后，加入EDTA、CTAB的乙二醇溶液、HF和濃硝酸，進(jìn)行水熱反應(yīng)，制得上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF₄:Yb,Tm；

(2)將步驟(1)制備的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料0.05g-0.2g分散于60mL-100mL異丙醇中；依次加入20mL-40mL的蒸餾水和2.5mL-5mL質(zhì)量濃度為25％的氨水，室溫下攪拌15min-30min；滴加40μL-80μL的正硅酸乙酯(TEOS)，攪拌3h后；滴加200μL-400μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室溫下反應(yīng)1h-2h后停止攪拌，室溫下陳化2h-6h；離心分離，得到的固體物質(zhì)經(jīng)蒸餾水洗滌三次，60℃-90℃烘干，得到硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料；

(3)將步驟(2)制得的硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料10mg-50mg，分散于5mL-8mL濃度為10mmol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加入1.25mL質(zhì)量濃度為25％戊二醛溶液，在室溫下振蕩1h-2h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用10mmol/L的PBS洗三次，重新分散于5mL-8mL濃度為10mmol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加入1mL濃度為0.1mg/mL-0.2mg/mL的親和素溶液中，在37℃振蕩17h-30h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用10mmol/L的PBS洗三次，得到親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料；

(4)將步驟(3)制備的親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料10mg-50mg均勻分散于10mmol/L的PBS中，加入200μL-300μL濃度為1μmol/L的恩諾沙星適配體溶液，在37℃振蕩17h-30h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用10mmol/L的PBS洗三次，得到恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料；