[發明專利]一種維生素B2高產菌株的篩選方法

在審

• 申請號: 201610398653.9
• 申請日: 2016-06-07
• 公開（公告）號: CN107475240A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 張國銀;孫向宇
• 申請（專利權）人: 上海希邁醫藥科技有限公司;上海創諾醫藥集團有限公司;赤峰制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;C12N1/36;C12R1/125
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙)31258
• 代理人: 何葆芳

技術領域

本發明涉及一種菌株的篩選方法，具體說，是涉及一種維生素B2高產菌株的篩選方法,屬于生物工程技術領域。

背景技術

維生素B2(化學式：C17H20N4O6，式量376.37)又叫核黃素，是一種水溶性B族維生素。維生素B2是人和動物體必需的維生素之一，為黃素酶類輔酶的組成部分，在生物體內主要以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，參與機體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應，在呼吸和生物氧化中起著重要作用，是生命活動中不可缺少的維生素。

目前，工業上應用的維生素B2生產方法主要由化學合成法、化學半合成法和微生物發酵法三種。與化學合成法相比，微生物發酵法具有生產工藝簡單、原料廉價以及對環境污染少、綠色可再生等優點。因此，生物方法生產維生素B2倍受世界維生素B2生產商的青睞，正在逐漸代替以石油為基礎的化學合成法。

維生素B2的生物發酵過程是一個復雜的代謝過程，發酵菌株是影響微生物發酵產量和經濟效益的關鍵因素之一。枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)由于具有發酵周期短、原料要求簡單等優點而廣泛的用于維生素B2的微生物發酵中。盡管有上述優點，但是采用常規的枯草芽胞桿菌進行維生素B2的微生物發酵，其維生素B2的產量還是不夠高，無法滿足維生素B2工業的高產、節能要求。因此，需要對枯草芽胞桿菌進行誘變篩選，選出能高效合成維生素B2的枯草芽胞桿菌株。

傳統意義上的菌株誘變多是通過誘變劑的作用造成對菌種的基因發生突變，導致菌株某些特性的改變。這種常規誘變，隨機性較大，實驗結果幾乎無可重復性，且經過誘變的菌株不穩定，很容易在傳代后恢復突變，造成菌株的不穩定，對菌株后續的篩選造成不利影響，進而不利于提高維生素B2的產量。因此，需要開發出一種新的枯草芽胞桿菌的篩選方法，以篩選出高產穩定的維生素B2菌株。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是提供一種維生素B2高產菌株的篩選方法，以克服現有技術中維生素B2產量不高的缺陷。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種維生素B2高產菌株的篩選方法，包括如下步驟：

a)原始菌株的預處理：將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)原始菌株(例如枯草芽孢桿菌168)涂布于平板培養基上進行培養，培養得到的平板用蒸餾水進行洗吹，得到枯草芽孢桿菌原始菌株的菌液；

b)將步驟a)得到的菌液在無菌條件下進行紫外誘變，得到紫外誘變菌株；

c)將步驟b)得到的紫外誘變菌株用甲基磺酸乙酯進行化學誘變，得到復合誘變菌株；

d)將步驟c)得到的復合誘變菌株接種到不同代謝底物類似物的基本培養基中進行培養馴化；

e)將經過上述步驟處理得到的菌株接種到營養培養基中進行培養，得到的營養培養物接種到發酵培養基中進行培養，篩選出生產維生素B2最高的菌株。

作為優選方案，步驟a)中，平板培養基為：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化鈉9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，瓊脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培養溫度均勻為37℃，培養時間為24-36小時。

作為優選方案，步驟b)中，紫外誘變時間為30-60s，誘變高度為40-80cm。

作為優選方案，步驟c)中，甲基磺酸乙酯誘變劑量為0.05-0.5mol/L，誘變時間為20-60分鐘。

作為優選方案，步驟d)中，代謝底物類似物包括8-氮鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、6-氮雜胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亞砜、玫瑰黃素，濃度為10-100mg/L；將上述代謝底物類似物進行隨機組合，分別加入到經過紫外誘變、化學誘變后得到的復合誘變菌株的菌液中，在基本培養基中進行培養。培養得到的菌株每24小時進行一次傳代培養，傳代培養5-10天，以考察菌株的傳代穩定性。

作為進一步優選方案，基本培養基為：葡萄糖4.5-5.5g/L，硫酸銨0.15-0.25g/L，磷酸氫二鉀1.5-2g/L，磷酸二氫鉀0.5-0.7g/L，檸檬酸鈉0.1-0.3g/L，色氨酸0.04-0.06g/L，瓊脂粉15-17g/L，pH7.0；培養溫度均勻為37℃，培養時間為24-48小時。