[發(fā)明專利]一種維生素B2高產(chǎn)菌株的篩選方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610398653.9
• 申請(qǐng)日: 2016-06-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107475240A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張國(guó)銀;孫向宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海希邁醫(yī)藥科技有限公司;上海創(chuàng)諾醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;赤峰制藥股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N13/00
• 分類號(hào): C12N13/00;C12N15/01;C12N1/36;C12R1/125
• 代理公司: 上海海頌知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)31258
• 代理人: 何葆芳

1.一種維生素B2高產(chǎn)菌株的篩選方法，其特征在于：包括如下步驟：

a)原始菌株的預(yù)處理：將枯草芽孢桿菌原始菌株涂布于平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的平板用蒸餾水進(jìn)行洗吹，得到枯草芽孢桿菌原始菌株的菌液；

b)將步驟a)得到的菌液在無(wú)菌條件下進(jìn)行紫外誘變，得到紫外誘變菌株；

c)將步驟b)得到的紫外誘變菌株用甲基磺酸乙酯進(jìn)行化學(xué)誘變，得到復(fù)合誘變菌株；

d)將步驟c)得到的復(fù)合誘變菌株接種到不同代謝底物類似物的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)馴化；

e)將經(jīng)過(guò)上述步驟處理得到的菌株接種到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出生產(chǎn)維生素B2最高的菌株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟a)中，平板培養(yǎng)基為：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化鈉9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，瓊脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培養(yǎng)溫度均勻?yàn)?7℃，培養(yǎng)時(shí)間為24-36小時(shí)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟b)中，紫外誘變時(shí)間為30-60s，誘變高度為40-80cm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟c)中，甲基磺酸乙酯誘變劑量為0.05-0.5mol/L，誘變時(shí)間為20-60分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟d)中代謝底物類似物包括8-氮鳥(niǎo)嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、6-氮雜胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亞砜、玫瑰黃素，濃度為10-100mg/L；將上述代謝底物類似物進(jìn)行隨機(jī)組合，分別加入到經(jīng)過(guò)紫外誘變、化學(xué)誘變后得到的復(fù)合誘變菌株的菌液中，在基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：基本培養(yǎng)基為：葡萄糖4.5-5.5g/L，硫酸銨0.15-0.25g/L，磷酸氫二鉀1.5-2g/L，磷酸二氫鉀0.5-0.7g/L，檸檬酸鈉0.1-0.3g/L，色氨酸0.04-0.06g/L，瓊脂粉15-17g/L，pH7.0；培養(yǎng)溫度均勻?yàn)?7℃，培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟e)中，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為：葡萄糖9.5-10.5g/L，蛋白胨9.5-10.5g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，牛肉膏4.5-5.5g/L，氯化鎂3.5-4.5g/L，瓊脂15-17g/L，pH7.2；培養(yǎng)溫度均勻?yàn)?7℃，培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟e)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖80-90g/L，酵母粉8-15g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，檸檬酸鈉4.5-5.5g/L，七水硫酸鎂0.4-0.6g/L，磷酸氫二鉀0.5-1.5g/L，磷酸二氫鉀0.4-0.6g/L，pH7.0；培養(yǎng)溫度均勻?yàn)?7℃，培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)。