[發(fā)明專利]一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B2的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610398645.4
• 申請日: 2016-06-07
• 公開（公告）號: CN107475344A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張國銀;邵蘭英
• 申請（專利權(quán)）人: 上海希邁醫(yī)藥科技有限公司;赤峰蒙廣生物科技有限公司
• 主分類號: C12P25/00
• 分類號: C12P25/00;C12R1/125
• 代理公司: 上海海頌知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)31258
• 代理人: 何葆芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)維生素B2的方法，具體說，是涉及一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B2的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

維生素B2(化學(xué)式：C17H20N4O6，式量376.37)又叫核黃素，是一種水溶性B族維生素。維生素B2是人和動物體必需的維生素之一，為黃素酶類輔酶的組成部分，在生物體內(nèi)主要以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，參與機體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應(yīng)，在呼吸和生物氧化中起著重要作用，是生命活動中不可缺少的維生素。

目前，工業(yè)上應(yīng)用的維生素B2生產(chǎn)方法主要由化學(xué)合成法、化學(xué)半合成法和微生物發(fā)酵法三種。與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)工藝簡單、原料廉價以及對環(huán)境污染少、綠色可再生等優(yōu)點。因此，生物方法生產(chǎn)維生素B2倍受世界維生素B2生產(chǎn)商的青睞，正在逐漸代替以石油為基礎(chǔ)的化學(xué)合成法。

維生素B2的生物發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的代謝過程，發(fā)酵菌株和發(fā)酵工藝條件是影響微生物發(fā)酵產(chǎn)量和經(jīng)濟效益的關(guān)鍵因素。枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)目前廣泛的用于維生素B2的微生物發(fā)酵中，但是采用常規(guī)的枯草芽胞桿菌進行維生素B2的微生物發(fā)酵，其維生素B2的產(chǎn)量還是不夠高，無法滿足維生素B2工業(yè)的高產(chǎn)、節(jié)能要求。因此，需要對枯草芽胞桿菌進行優(yōu)化培養(yǎng)，以制備出能高效合成維生素B2的枯草芽胞桿菌株。同時影響發(fā)酵過程的因素非常復(fù)雜，包括培養(yǎng)基組成、pH值、培養(yǎng)溫度、通氣量等一系列操作條件，這些條件往往不是獨立影響發(fā)酵過程，而是常常存在交互作用的。因此，同時需要優(yōu)化出一種適宜的發(fā)酵工藝。

因此，需要開發(fā)出一種利用高產(chǎn)穩(wěn)定的枯草芽胞桿菌生產(chǎn)維生素B2的方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B2的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中維生素B2產(chǎn)量不高的缺陷。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B2的方法，包括如下步驟：

a)菌株活化：將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 15-1-11先轉(zhuǎn)斜面在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-32h，準(zhǔn)備移種；

b)種子培養(yǎng)：將活化后的菌株以5％的接種量接入種子培養(yǎng)基中進搖瓶培養(yǎng)12-16h，培養(yǎng)溫度40℃，轉(zhuǎn)速240rpm，制得種子培養(yǎng)液；

c)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48-60h，發(fā)酵溫度為38-40℃，以30％(v/v)NH₄OH和1M H₂SO₄控制pH為6.7～6.9，控制通氣比為0.8，使溶氧量達(dá)到20-30％，轉(zhuǎn)速600rpm；

d)維生素B2提取：發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心后取上清，即得維生素B2，檢測發(fā)酵液中維生素B2的含量。

作為優(yōu)選方案，所述枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 15-1-11的制備，包括如下步驟：

a1)原始菌株的預(yù)處理：將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)原始菌株(例如枯草芽孢桿菌168)涂布于平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的平板用蒸餾水進行洗吹，得到枯草芽孢桿菌原始菌株的菌液；

b1)將步驟a1)得到的菌液在無菌條件下進行紫外誘變，得到紫外誘變菌株；

c1)將步驟b1)得到的紫外誘變菌株用甲基磺酸乙酯進行化學(xué)誘變，得到復(fù)合誘變菌株；

d1)將步驟c1)得到的復(fù)合誘變菌株依次接種到代謝底物類似物8-氮鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、6-氮雜胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亞砜、玫瑰黃素的基本培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)馴化，制得兼具8-氮鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、6-氮雜胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亞砜、玫瑰黃素的抗性突變株；

e1)將經(jīng)過上述步驟處理得到的菌株接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到的營養(yǎng)培養(yǎng)物接種到菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，篩選出生產(chǎn)維生素B2最高的菌株，即為所述的菌株Bacillus subtilis 15-1-11。

作為進一步優(yōu)選方案，步驟a1)中，平板培養(yǎng)基為：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化鈉9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，瓊脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培養(yǎng)溫度均勻為37℃，培養(yǎng)時間為24-36小時。

作為進一步優(yōu)選方案，步驟b1)中，紫外誘變時間為30-60s，誘變高度為40-80cm。