[發明專利]一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產維生素B2的方法

在審

• 申請號: 201610398645.4
• 申請日: 2016-06-07
• 公開（公告）號: CN107475344A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 張國銀;邵蘭英
• 申請（專利權）人: 上海希邁醫藥科技有限公司;赤峰蒙廣生物科技有限公司
• 主分類號: C12P25/00
• 分類號: C12P25/00;C12R1/125
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙)31258
• 代理人: 何葆芳

1.一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產維生素B2的方法，其特征在于：包括如下步驟：

a)菌株活化：將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 15-1-11先轉斜面在37℃培養箱中培養24-32h，準備移種；

b)種子培養：將活化后的菌株以5％的接種量接入種子培養基中進搖瓶培養12-16h，培養溫度40℃，轉速240rpm，制得種子培養液；

c)發酵培養：將種子培養液接入發酵罐中發酵培養基培養48-60h，發酵溫度為38-40℃，以30％(v/v)NH₄OH和1M H₂SO₄控制pH為6.7～6.9，控制通氣比為0.8，使溶氧量達到20-30％，轉速600rpm；

d)維生素B2提?。喊l酵結束后，發酵液離心后取上清，即得維生素B2，檢測發酵液中維生素B2的含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 15-1-11的制備，包括如下步驟：

a1)原始菌株的預處理：將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)原始菌株(例如枯草芽孢桿菌168)涂布于平板培養基上進行培養，培養得到的平板用蒸餾水進行洗吹，得到枯草芽孢桿菌原始菌株的菌液；

b1)將步驟a1)得到的菌液在無菌條件下進行紫外誘變，得到紫外誘變菌株；

c1)將步驟b1)得到的紫外誘變菌株用甲基磺酸乙酯進行化學誘變，得到復合誘變菌株；

d1)將步驟c1)得到的復合誘變菌株依次接種到代謝底物類似物8-氮鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、6-氮雜胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亞砜、玫瑰黃素的基本培養基中進行培養馴化，制得兼具8-氮鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、6-氮雜胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亞砜、玫瑰黃素的抗性突變株；

e1)將經過上述步驟處理得到的菌株接種到營養培養基中進行培養，得到的營養培養物接種到菌株發酵培養基中進行培養，篩選出生產維生素B2最高的菌株，即為所述的菌株Bacillus subtilis 15-1-11。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟a1)中，平板培養基為：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化鈉9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，瓊脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培養溫度均勻為37℃，培養時間為24-36小時。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟b1)中，紫外誘變時間為30-60s，誘變高度為40-80cm。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟c1)中，甲基磺酸乙酯誘變劑量為0.05-0.5mol/L，誘變時間為20-60分鐘。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟d1)中，代謝底物類似物的濃度為10-100mg/L，具體馴化操作如下：首先將經過紫外誘變、化學誘變后得到的復合誘變菌株的菌液涂布在含有10-100mg/L 8-氮鳥嘌呤的基本培養基中，在37℃培養5-10天，選出8-氮鳥嘌呤抗性突變株；接著將篩選出的8-氮鳥嘌呤抗性突變株的菌液涂布在含有10-100mg/L8-氮雜腺嘌呤的基本培養基中，在37℃培養5-10天；按照上述方法接菌培養6-氮雜胸腺嘧啶抗性突變株、DL-蛋氨酸亞砜抗性突變株、玫瑰黃素抗性突變株，最終得到兼具8-氮鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、6-氮雜胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亞砜、玫瑰黃素的抗性突變株。