[發明專利]一種同時測定酶促反應液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法

有效

• 申請號: 201610396483.0
• 申請日: 2016-06-07
• 公開（公告）號: CN106596749B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 趙東明;歐陽暉
• 申請（專利權）人: 湖北遠大生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京元周律知識產權代理有限公司 11540
• 代理人: 李花

本發明提供了一種同時測定酶促反應液中DL?ATC、L?半胱氨酸和L?胱氨酸含量的方法，該方法包括先調節所述酶促反應液的pH值，再用HPLC法對酶促反應液中DL?ATC、L?半胱氨酸和L?胱氨酸進行分離并且同時測定。本發明的方法中，通過調節酶促反應液的pH值范圍，實現了酶促反應液中DL?ATC、L?半胱氨酸和L?胱氨酸的濃度在一定時間內保持穩定，再通過高效液相色譜法，能實現酶促反應液中DL?ATC、L?半胱氨酸和L?胱氨酸含量的快速同時測定。

技術領域

本發明涉及一種HPLC法同時測定酶促反應液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的高效液相色譜法，屬于生物分析領域。

背景技術

L-半胱氨酸是一種重要含硫氨基酸，也是組成蛋白質的20多種氨基酸中唯一含有巰基的α-氨基酸。L-半胱氨酸具有許多重要的生理作用，目前已經廣泛應用于醫藥、食品、保健品、化妝品以及飼料工業等多個領域。

L-半胱氨酸的市場需求量很大，目前其主要的生產方式為毛發水解法，雖然工藝相對簡單，但是能耗較大，環境污染嚴重。近年來酶轉化法由于其具有立體選擇性好、可獲得單一構型產物、產物純度高、反應條件溫和和對環境友好等優點而日益受到重視，已經逐漸成為研究熱點之一。

酶轉化法生產L-半胱氨酸的方法目前主要有三種工藝路線，其中之一就是以DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)為起始原料，通過酶促反應生產L-半胱氨酸。日本學者Sano等在1977年首次發明這種方法，他們在土壤中篩選了一些假單胞菌，以添加甘油和DL-ATC為底物成功合成L-半胱氨酸。1990年韓國學者Ryu等也完成了由DL-ATC向L-半胱氨酸酶法轉化的最佳培養條件和酶促反應條件研究。在這些研究中酶促反應的條件大多是在堿性條件下進行的，而L-半胱氨酸在酸性條件相對穩定，在中性及堿性溶液中極易被空氣氧化成為L-胱氨酸。而酶促反應生產L-半胱氨酸的反應液中，DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸等三者同時存在，在酶的催化作用下，DL-ATC轉化為L-半胱氨酸，與此同時在堿性條件下L-半胱氨酸又被空氣氧化而生成L-胱氨酸，這種動態的變化為三者含量的準確定量帶來了極大的困難。

目前L-半胱氨酸傳統的測定方法有分光光度法、紙層析法、電化學測定法等，但是由于酶促反應液的成分較為復雜，難以排除雜質干擾，因此上述方法很難應用于酶促反應液中L-半胱氨酸的檢測。在堿性的酶促反應液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量極不穩定，普通的方法很難滿足三者的同時準確定量檢測的要求，因此開發一種簡便的方法用于穩定酶促反應液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸的含量，同時快速和準確地實現三者含量的同時測定具有十分重要的現實意義。

經文獻檢索，目前HPLC法同時測定酶促反應液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法目前并未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種同時測定酶促反應液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種同時測定酶促反應液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法，其特征在于，包括先調節所述酶促反應液的pH值，再用HPLC法對酶促反應液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸進行分離并且同時測定。

本發明中，在進行HPLC法檢測時使用的色譜柱為正相硅膠鍵合二醇色譜柱。

本發明中，在進行HPLC法檢測時，檢測條件為：水相溶液pH為1.0～5.0，水相-有機相體積比為15:85～30:70，檢測波長為190-300nm，柱溫為20～40℃，進樣量為5～20μL；優選所述檢測波長為200nm。

本發明中，在調節所述酶促反應液的pH值時所用的酸為鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、醋酸或甲酸中的一種或多種。