[發(fā)明專利]可利用化學修飾核苷酸的RNA聚合酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610392442.4
• 申請日: 2016-06-06
• 公開（公告）號: CN107460177B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發(fā)明（設計）人: 張海生;李強
• 申請（專利權）人: 張海生
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/10
• 代理公司: 北京律恒立業(yè)知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11416
• 代理人: 龐立巖;顧珊

本發(fā)明通過導入新穎性突變，提供了一種T7RNA聚合酶突變體，其選自：SEQ ID NO:1所示的構成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突變體(R632C)，所述T7RNA聚合酶突變體具有DNA依賴的RNA聚合酶活性，且與野生型T7RNA聚合酶相比，所述T7RNA聚合酶突變體可以各種2’修飾三磷酸核苷作為合成底物。以及合成該突變體、含有一種或多種修飾核苷酸的核酸的方法和試劑盒。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及酶工程領域，具體的講本發(fā)明涉及T7 RNA聚合酶的改良突變體，所述突變導致酶合成利用修飾三磷酸核苷合成RNA性能的改善。

背景技術

T7 RNA聚合酶(E.C.2.7.7.6.)是一種單體的噬菌體編碼的DNA指導的RNA聚合酶，其催化5'→3'方向的RNA形成。在轉錄啟動的過程中，T7識別特定的啟動子序列，即T7啟動子。T7由883個氨基酸組成，且具有99kDa的分子量。在氨基酸序列水平，T7與T3RNA聚合酶具有高度同源性，且與SP6RNA聚合酶具有更低的程度的同源性。T7的三維結構非常類似于具有不同模板和底物特異性的其它聚合酶，盡管存在低序列相似性。T7由不同的結構域組成：N-端結構域、“拇指”、“掌”和“指”(Sousa,R.,和Mukherjee,S.,Prog.Nucl.AcidRes.Mol.Biol.73(2003)1-41)。轉錄反應的詳細研究證實，該酶象分子機器一樣起作用，表現(xiàn)出該酶的柔性部分的非常協(xié)調的動作(Steitz,T.A.,EMBO J.25(2006)3458-3468；Steitz,T.A.,Curr.Opin.Struct.Biol.14(2004)4-9；Yin,Y.W.,和Steitz,T.A.,Cell 116(2004)393-404)。

解析了與啟動子DNA復合的T7的幾種結構，且可在蛋白數(shù)據(jù)庫(pdb)得到。在高分辨率解析了T7 RNA聚合酶的起始復合物的結構(Cheetham,G.M.T.,等人,Nature 399(1999)80-83；Cheetham,G.M.T.,和Steitz,T.A.,Science 286(1999)2305-2309)。在2.9A分辨率解析的延伸復合物的結構顯示出N-端區(qū)域的重排(Tahirov,T.H.,等人,Nature 420(2002)43-50)。結構研究表明，N-端結構域的構象會在起始和延伸階段之間改變。最近，描述了從起始向延伸階段變遷的轉錄T7的結構(Durniak,K.J.,等人,Science 322(2008)553-557)。

已經(jīng)描述了編碼T7的基因的克隆和表達(Studier等人,US 4,952,496)，通過誘變集中地研究了T7，以探究轉錄過程中的構象變化(Ma,K.,等人,Proc.Nat.Acad.Sci.102(2005)17612-17617)，以促進啟動子清除(Guillerez,J.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.102(2005)5958-5963)，或研究失敗的循環(huán)現(xiàn)象(He,B.,等人,J.Mol.Biol.265(1997)275-288)。Bonner,G.,等人,J.Biol.Chem.269(1994)25120-25128描述了一組具有改變的延伸速率的活性部位突變體。由于啟動子特異性和高RNA聚合酶酶活性，T7可用于分子生物學中的多種用途。在重組蛋白表達領域，T7被用于重組基因在大腸桿菌中的高水平表達(Studier,F.W.,和Moffat,B.A.,J.Mol.Biol.189(1986)113-130)。Milligan,J.F.,等人,Nucl.Aids Res.15(1987)8783-8798描述了確定的寡核糖核苷酸的合成。