[發明專利]可利用化學修飾核苷酸的RNA聚合酶突變體

有效

• 申請號: 201610392442.4
• 申請日: 2016-06-06
• 公開（公告）號: CN107460177B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發明（設計）人: 張海生;李強
• 申請（專利權）人: 張海生
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/10
• 代理公司: 北京律恒立業知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11416
• 代理人: 龐立巖;顧珊

1.一種T7 RNA聚合酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述T7 RNA聚合酶突變體具有DNA依賴的RNA聚合酶活性，且與野生型T7 RNA聚合酶相比，所述T7 RNA聚合酶突變體可以2’-氧-甲基修飾三磷酸核苷作為合成底物。

2.一種基因，所述基因編碼權利要求1所述的T7 RNA聚合酶突變體，其DNA序列如SEQID NO：2所示。

3. 一種細胞，所述細胞能夠表達編碼權利要求2所述的T7 RNA聚合酶突變體的基因從而生產T7 RNA聚合酶。

4. 一種制備權利要求1所述的T7 RNA聚合酶突變體的方法，其包括如下步驟：

(1)從氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列的N-端開始編號，選擇第632位的Arg；

(2)用Cys氨基酸置換所選擇的氨基酸，形成T7 RNA聚合酶突變體；

(3)在表達體系中表達核酸分子，其為編碼步驟(2)的T7 RNA聚合酶突變體的核苷酸序列，并從所述表達體系分離表達所述T7 RNA聚合酶突變體。

5.一種制備含有一種修飾核苷酸的核酸的方法，具體步驟包括：

(1)制備轉錄反應混合物，包括權利要求1所述的T7 RNA聚合酶突變體、2’-氧-甲基修飾三磷酸核苷酸、鎂離子、和核苷酸轉錄模板；

(2)在一定條件下轉錄上述核苷酸模板，由此所述T7 RNA聚合酶突變體高效利用所述2’-氧-甲基修飾三磷酸核苷酸底物合成2’-氧-甲基修飾RNA分子。

6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述轉錄反應混合物中還包括亞精氨。

7. 一種用于合成含有一種修飾核苷酸的核酸分子的試劑盒，其在單獨的容器中包括權利要求1所述的T7 RNA聚合酶突變體或根據權利要求4的方法得到的T7 RNA聚合酶突變體、以及含有2’-氧-甲基修飾三磷酸核苷酸的緩沖液。