[發(fā)明專利]一種糞腸球菌間接血凝檢測試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610381927.3
• 申請日: 2016-06-01
• 公開（公告）號: CN105929179B
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉永生;李學(xué)瑞;周建華;馬麗娜;劉永安;王立燕
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11249
• 代理人: 呂玉博

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于用于微生物的檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種糞腸球菌間接血凝檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是革蘭氏陽性，過氧化氫陰性球菌，是人和動物腸道內(nèi)主要菌群之一。自20世紀(jì)80年代以來，糞腸球菌已逐漸成為人和動物重要的條件性致病菌，可引起菌血癥、尿道感染、心內(nèi)膜炎等疾病。目前，在動物疾病診斷方面，糞腸球菌感染主要依靠實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離、PCR分子生物學(xué)鑒定，在基層則缺乏快速有效的糞腸球菌血清學(xué)診斷方法。血清學(xué)診斷方法的缺乏，可能使得基層對糞腸球菌感染造成誤診及漏診，從而對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成不必要的損失。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種糞腸球菌間接血凝檢測試劑盒及其應(yīng)用。

本申請采用超聲細(xì)胞破碎法提取糞腸球菌菌體抗原作為檢測抗原，致敏醛化鞣酸化的綿羊紅細(xì)胞，與糞腸球菌高免兔血清，糞腸球菌陽性血清進(jìn)行間接血凝實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示該方法特異性好、靈敏度高，可為糞腸球菌病的血清學(xué)快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。

本申請?zhí)峁┮环N糞腸球菌間接血凝檢測試劑盒，所述試劑盒包括糞腸球菌間接血凝抗原，所述糞腸球菌間接血凝抗原由糞腸球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸化綿羊紅細(xì)胞組成。

作為優(yōu)選，所述糞腸球菌全菌蛋白的濃度為20μg/ml-40μg/ml。

作為優(yōu)選，所述糞腸球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸化綿羊紅細(xì)胞的體積比為1:1。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括稀釋液。

作為優(yōu)選，所述糞腸球菌間接血凝抗原的制備方法為：

（1）糞腸球菌菌體抗原的制備

對糞腸球菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收獲菌體后，洗滌，重懸，再于冰浴中以超聲波間歇破碎10min，離心取上清，得到糞腸球菌菌體抗原懸浮液；

（2）紅細(xì)胞的固定和醛化-鞣酸化

將保存于Alsever's 液中的公綿羊血在4℃靜置3-7天后，按常規(guī)方法對綿羊紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌、戊二醛固定和鞣酸處理，所用的溶液均為 pH 7.2濃度為0.15M的PBS，制備好的綿羊紅細(xì)胞用 pH7.2濃度為0.15M的PBS懸浮至5%濃度，得到醛化-鞣酸化后的紅細(xì)胞懸液；

（3）糞腸球菌間接血凝抗原的制備

以步驟（1）得到的糞腸球菌菌體抗原致敏步驟（2）得到的紅細(xì)胞，得到糞腸球菌間接血凝抗原，糞腸球菌間接血凝抗原的終濃度為20μg/ml-40μg/ml。

本發(fā)明還提供上述試劑盒在檢測糞腸球菌中的應(yīng)用，所述應(yīng)用是非疾病的診斷和治療目的的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，同時檢測n（n≤9）個待測抗原的具體方法為：

（1）在滴定板1-n列每列第1孔分別加入待檢血清，第n+1、n+2、n+3分別加入同樣體積的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和空白對照，將1-n+2列從第1孔開始進(jìn)行4倍倍比稀釋至最后一孔；

（2）每孔加入糞腸球菌間接血凝抗原；

（3）震蕩滴定板，充分混勻，置37℃恒溫箱1.5-2h；

（4）根據(jù)紅細(xì)胞凝集程度判定待檢血清效價，以出現(xiàn)50%紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價。

本發(fā)明的優(yōu)越性包括以下方面：（1）本發(fā)明中抗原為糞腸球菌菌體抗原，具有很強(qiáng)的特異性，能真實(shí)地檢測糞腸球菌抗體；（2）用蛋白致敏醛化-鞣酸化綿羊紅細(xì)胞，避免了新鮮綿羊紅細(xì)胞保存時間短、致敏效價低的缺點(diǎn)，易于長時間保存，血凝效價高。（3）操作簡單、方便快速，無需特殊設(shè)備和儀器，全程在2～3小時內(nèi)完成，適合在基層推廣應(yīng)用，可廣泛應(yīng)用于糞腸球菌病流行病學(xué)的調(diào)查研究。（4）結(jié)果的重復(fù)性好，穩(wěn)定，可靠，能夠準(zhǔn)確的檢測糞腸球菌的抗體。（5）本發(fā)明是目前國內(nèi)唯一的檢測糞腸球菌抗體的診斷試劑，且價格低廉，安全穩(wěn)定，無毒性，無環(huán)境污染。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市售。

實(shí)施例1 糞腸球菌間接血凝診斷試劑盒的制備

糞腸球菌間接血凝診斷試劑盒的組分如下：

（1）糞腸球菌間接血凝抗原1瓶，10ml/瓶；

（2）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清1瓶，1ml/瓶；