[發明專利]基因輸送載體及其制備與應用

在審

• 申請號: 201610367835.X
• 申請日: 2016-05-30
• 公開（公告）號: CN107441506A
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 徐宇虹;張琰;曹婧;魏曉慧;許風偉;魏爽
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K47/22;A61K47/16;A61K47/18
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙)31219
• 代理人: 李艷,許亦琳

技術領域

本發明屬于藥物制劑研發領域，具體涉及一種基因輸送載體及其制備與應用。

背景技術

基因治療是指將具有治療意義的外源基因藥物導入靶細胞用以糾正異常基因或者補償缺失基因、使相應蛋白正常表達，從而達到治療目的技術。基因治療可用于有效治療先天及后天性疾病，并且已在例如癌癥、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、心臟病、傳染病、囊泡性纖維癥、X染色體相關重度免疫缺陷(X-linked SCID)等疾病治療中顯示出其巨大的潛力。僅從理論上講，基因治療的概念并不難理解，即異常基因替換和缺失基因補償；事實上，基因治療存在著諸多亟待解決的難題，致使其臨床應用發展受到阻礙。利用合適的載體將基因藥物輸送至靶細胞，突破基因藥物面臨的生物屏障，是基因治療的關鍵環節。

常見基因藥物有小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、質粒DNA(plasmid DNA,pDNA)、小發卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)、反義寡核苷酸(anti-sense oligonucleotides,ODN)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)等。其中，siRNA是目前研究最多、應用最廣的基因藥物。siRNA是一類具有20～25個堿基對的雙鏈RNA，可以與序列互補的目標mRNA相結合，促使mRNA的降解，從而影響相應蛋白的合成。shRNA是在siRNA的基礎上發展起來的。siRNA的穩定性差，容易被RNA酶降解，shRNA是一段具有緊密發卡環的RNA序列，與RNA作用機制相同，都是通過RNA干擾效應實現靶基因的沉默。

質粒DNA，即pDNA，是一類自然存在常見于細菌中的小型環狀雙鏈DNA分子，有時也見于古生菌和真核細胞中。質粒DNA常常承載著可能對生物體存活有利的基因序列，例如抗生素耐藥性基因。pDNA常常被視作復制子，它可以在不同的宿主生物體中實現自主復制。在基因工程中，人工構建的質粒常常用作特殊基因的載體。pDNA在基因治療中具有重要的研究潛力，經過改造的pDNA可用于實現細胞內缺失的蛋白在基因組水平上的補償和糾正。近幾年興起的CRISPR/CAS9基因編輯技術也可以通過構建相應的pDNA實現由RNA指導Cas9蛋白對靶向基因的修飾。

基因藥物的導入方法常分為三種：物理方法、病毒載體介導方法及非病毒載體介導 方法。

物理方法即是通過電穿孔、高壓注射、磁轉染、基因槍等方式將基因藥物輸送至靶細胞內。這些物理方法大都能夠高效地實現基因藥物直接進入細胞并實現表達，但是仍存在諸多問題，比如高壓注射的方式能夠高效地實現DNA在肝細胞中的表達，但是這一方法僅限于實驗用小動物并未用于人體；電穿孔的方法已在體外及體內皮膚、肌肉、腫瘤等組織實現良好的轉染效果，但是無法對人體內部組織進行有效的基因輸送，且由于會有一定的電壓刺激，極有可能引起的病人的不適應性及對組織器官的損傷，也可能會對基因組DNA的穩定性造成破壞。物理方法在實驗用小動物上應用較多。

病毒載體介導的基因輸送具有高效、準確的特點，這是由病毒載體自身的感染機制決定的。目前，70%的基因治療的臨床試驗都是使用經過改造的逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒及腺相關病毒來輸送基因藥物。盡管病毒載體大大促進了基因治療領域的發展，但是以病毒為載體進行基因治療仍有很大的局限性，包括潛在的致瘤性、免疫原性及廣泛的組織嗜性，并且該類型載體對DNA的裝載能力較低且制備復雜。

相比之下，非病毒載體應用于基因治療能夠解決病毒載體存在的局限，特別在安全性方面要遠遠優于病毒載體。盡管非病毒載體在靶向輸送載體的能力上較病毒載體有所不足，但能夠實現對基因藥物的高效裝載，制備也較為簡單易行。在此基礎上，非病毒載體受到研究者們的高度關注，包括脂質體、高聚物、聚合物泡囊、穿膜肽以及無機納米粒子等在內的載體系統也成為基因治療的研究熱點。

非病毒載體想要發揮作用，僅僅克服胞外屏障是不夠的。載體還需要進入組織細胞內，實現溶酶體逃逸，才能將基因藥物釋放至細胞質中。對于siRNA、mRNA、miRNA等基因藥物，只需要被釋放至胞質中即可發揮作用；對于DNA類基因藥物，除了要釋放至細胞質中，還需要DNA通過核孔進入細胞核才能夠實現表達。

因此，尋找能夠有效輸送包括DNA類藥物在內的基因藥物的載體，是非常重要的。

發明內容

為了克服現有技術中所存在的問題，本發明的目的在于提供一種基因輸送載體其制備與應用。

為了實現上述目的以及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：