[發明專利]檢測水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的RT?PCR及其應用有效
申請號: | 201610363054.3 | 申請日: | 2016-05-26 |
公開(公告)號: | CN107130057B | 公開(公告)日: | 2018-02-09 |
發明(設計)人: | 周羽;王振華;李新海;翁建峰;邸宏;張泓;祖洪月;張曉明 | 申請(專利權)人: | 東北農業大學 |
主分類號: | C12Q1/70 | 分類號: | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94 |
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摘要: | |||
搜索關鍵詞: | 檢測 水稻 黑條矮縮 病毒 南方 rt pcr 及其 應用 | ||
技術領域
本發明涉及PCR檢測技術領域,特別是涉及用于檢測水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的靶序列、RT-PCR引物,本發明還涉及利用該靶序列進行水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒檢測的方法和試劑盒。
背景技術
玉米粗縮病(Maize rough dwarf disease,MRDD)是危害玉米生產的世界性病毒病害之一,在我國玉米產區發生嚴重。2008年到2013年,玉米粗縮病導致產量嚴重損失,普遍達到30%至50%,嚴重地區可達80%以上,甚至絕收。
玉米粗縮病病源主要有四種,均屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)。在歐洲,病源是玉米粗縮病毒(Maize rough dwarf virus,MRDV);南美洲病源是馬德里約柯托病毒(Mal de Rí o Cuarto Virus,MRCV);在亞洲導致玉米粗縮病的病源是水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)或南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV),我國黃淮海地區主要病源是RBSDV,廣東、海南以及越南和日本等地區的病源主要是SRBSDV。以上病毒同時也是水稻黑條矮縮病(Rice black-streaked dwarf disease,RBSDD)和小麥綠矮病(Wheat green dwarf disease,WGDD)等病害的主要病源。
玉米粗縮病病源RBSDV、MRDV和MRCV均是以灰飛虱(Laodelphax striatellus,SBPH)為傳播介體以持久性傳播;而近期發現的SRBSDV是以白背飛虱(Sogatella furcifera,WBPH)為介體持久性傳播。四種病毒在寄主范圍、血清學關系、病毒粒子結構、介體傳毒方式及植物寄主發病方式等方面均較為相似,但通過基因序列比對確定其為兩種不同病毒。
RBSDV完整病毒粒子為等軸的20面球體,直徑約為70-80nm,其基因組由10條線性雙鏈RNA(dsRNA)組成,10條雙鏈dsRNA按在PAGE電泳中遷移率由慢到快分別命名為S1-S10,大小從4.5kb到1.8kb。目前研究表明,基因組共有13個開放閱讀框(open reading frame,ORF),S5、S7和S9區段分別含有兩個ORF,其中S5區段的兩個ORF部分重疊,其余7條基因組區段均只有一個ORF。
目前,常用的檢測植物病毒的方法主要包含:分子方法檢測,電鏡觀察,血清學檢測以及生物學接種試驗等。但以上檢測方法很難準確鑒定病原,且操作方法相對復雜。
為了提高水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒檢測的準確性和便捷性,有必要建立靈敏度更好、特異性更好的檢測方法來鑒定RBSDV和SRBSDV。
發明內容
本發明的目的在于提供用于檢測水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的特異、靈敏、快速、簡便的方法及其應用。
為實現上述目的,本發明通過對多年多點水稻黑條矮縮病毒基因核苷酸區段進行測序和比對,確定了保守區S5區段序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,該靶序列是檢測水稻黑條矮縮病毒的遺傳標記物。此外,本領域技術人員應當理解,該序列的特異性區段也可以作為檢測水稻黑條矮縮病毒的遺傳標記物。同時,在此區段內篩選到水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒一致性最低的序列。本發明根據該保守序列,通過反復對比、篩選,設計了用于檢測并區分水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒遺傳標志物的特異性引物對。
在本發明的一個實施方式中,優選的RBSDV特異性引物對的序列為:
RS5-F:ACGATCTTCTCGACCAAACC(SEQ ID NO.1)(RBSDVS5中位置:2436-2455)
RS5-R:AGCAAGAGTTGAAACACAACCG(SEQ ID NO.2)(RBSDV S5中位置:2834-2855)
優選的SRBSDV特異性引物對的序列為:
SS5-F:ACGATCTTCTCGACCAAACC(SEQ ID NO.3)(SRBSDVS5中位置:2439-2458)
SS5-R:AGCTTATCATCGCGCTGTAGT(SEQ ID NO.4)(SRBSDV S5中位置:2821-2841)
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