[發(fā)明專利]L-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610362019.X
• 申請日: 2016-05-27
• 公開（公告）號: CN107435056A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 易菊陽;劉立明;陳建華;潘崇德
• 申請（專利權(quán)）人: 紹興百茵生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12P13/24
• 分類號: C12P13/24;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種氨基酸衍生物的制備方法，具體地指一種L-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)是膠原蛋白的主要組成部分，不屬于20種常見的氨基酸。近年來，L-羥脯氨酸的研究與開發(fā)已經(jīng)引起醫(yī)藥、生化、食品及美容業(yè)等方面的廣泛關(guān)注。它可以作為化妝品添加劑，具有抗氧化、抗輻射的作用；它亦具有減肥作用，可望成為比較理想的減肥藥物；它還具有多種生理功能與獨特的生物活性，既可作為各種軟組織疾病的藥物，如結(jié)締組織受損、風濕性關(guān)節(jié)炎等，又可加快傷口愈合，以及治療各種皮膚疾病。L-羥脯氨酸作為氨基酸注射液的重要組分，對急慢性肝病所導(dǎo)致的低蛋白血癥有一定的療效；它參與脂肪的乳化及紅細胞血紅素和球蛋白的形成，具有調(diào)節(jié)脂肪乳化等作用；它還是多種藥物，如第三代抗生素、抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等的合成原料。L-羥脯氨酸是碳青霉烯(培南類)抗生素原料合成的醫(yī)藥中間體，碳青霉烯類藥物是迄今為止抗菌譜最廣、抗菌活性較強的抗生素，隨著青霉素、頭孢類等傳統(tǒng)抗生素耐藥菌問題日益嚴峻，碳青霉烯類抗生素正扮演著抗臨床重癥感染最后一道防線的重要角色，市場銷售量大。

現(xiàn)有技術(shù)中，L-羥脯氨酸的生產(chǎn)方法主要有發(fā)酵法、酶法、蛋白水解提取法、化學合成法；目前，實驗室多采用發(fā)酵法，但是因為羥脯氨酸的結(jié)構(gòu)特殊，發(fā)酵法尚不能生產(chǎn)；化學合成方法成本太高；所以從膠原蛋白中分離提取是一種重要途徑。以蛋白質(zhì)為原料經(jīng)酸、堿或蛋白水解酶水解后，再分離純化各種氨基酸的工藝過程，簡稱水解 法。水解法主要有酸水解法、堿水解法和酶水解法三種。堿法會引起氨基酸消旋，酶法水解的缺點是反應(yīng)不完全，中間產(chǎn)物如肽類較多，一般時間較長，易污染菌，在氨基酸生產(chǎn)中很少應(yīng)用，所以目前制備羥脯氨酸一般采用酸解法，反應(yīng)過程如下：

這一提取路線中采用了亞硝化法，原理是利用NaNO₂在酸性條件下把α-氨基酸的氨基破壞掉，變?yōu)榱u羧酸，而將亞氨酸羥脯氨酸和脯氨酸反應(yīng)成為亞硝胺，加酸水解后又變?yōu)閬喯跛幔瑥亩薛?氨基酸除去，利于后續(xù)的離子交換。

也有未采用上述工藝的報道，其改進工藝是在水解液脫色之后利用各種氨基酸等電點的不同，直接離子交換分離。脫色步驟采用活性炭，離子交換樹脂主要為陽離子交換樹脂D61和732型，洗脫液主要有氨水和氯化銨溶液。在最終得到羥脯氨酸晶體時，還可以得到脯氨酸副產(chǎn)品，羥脯氨酸的得率只有4～7％，并且還有很多的具體工藝步驟仍需要完善和改進，如改進水解設(shè)備、改進水解液脫酸工藝選用中和法或離子交換法脫酸、改進脫色工藝采用可回收利用的樹脂，工藝步驟可以部分合并縮減等。

公布號為CN103509813A的中國發(fā)明專利申請公開了一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-4羥脯氨酸的方法，通過將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的脯氨酸-4-羥化酶基因連接在高效啟動子上，在大腸桿菌中過量表達該羥化酶，在發(fā)酵培養(yǎng)基中以葡萄糖為碳源，并通過添加L-脯氨酸來獲得L-4-羥脯氨酸。但是，該方法是單純利用生物方法制備，產(chǎn)率較低，光學純度也不高。

上個世紀80年代中期，國外加強了羥脯氨酸的開發(fā)與應(yīng)用研究， 其年需量也急劇增加。而我國現(xiàn)在每年有大量的動物膠出口到國外用于提取羥脯氨酸和其它氨基酸，其中的一些再返銷我國。

因此，研發(fā)一種產(chǎn)率高、低成本的L-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化方法具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的問題就是克服背景技術(shù)不足，提供一種L-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化方法，該方法通過一種微生物/酶催化的技術(shù)，利用藥物的手性前體實現(xiàn)高效、低成本、無污染的生物催化合成體系，而后制備L-羥脯氨酸。

含脯氨酸-4-羥化酶的工程菌全細胞的制備過程大體過程如下：

人工合成脯氨酸4-羥化酶基因(基因號：D78338.1)，基因來源于指孢囊菌。人工合成過程委托上海桑尼生物技術(shù)有限公司進行密碼子優(yōu)化。然后用現(xiàn)代分子技術(shù)手段，將合成基因克隆到pET28a上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET28a-Hyp。進一步，對pET28a-Hyp載體的RBS區(qū)進行改造，經(jīng)高通量篩選后，將轉(zhuǎn)化效率高的重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主BL21(DE3)實現(xiàn)外源表達。后續(xù)轉(zhuǎn)化優(yōu)化全細胞均為BL21(pET28a-Hyp)。