[發(fā)明專利]一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株選育方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610351278.2
• 申請日: 2016-05-25
• 公開（公告）號: CN105779431A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何榮軍;王茜;孫培龍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N1/02
• 代理公司: 杭州之江專利事務(wù)所(普通合伙) 33216
• 代理人: 朱楓

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于菌株選育的技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株選育方法。

背景技術(shù)

自然界中通過自然選育方法分離篩選出的菌種存在著菌種活力低和對物理、化學(xué)因素抵抗力低等缺點，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，因此誘變育種成為解決這種不足的唯一出路，并成為目前工業(yè)微生物選育最常用的方法。誘變育種是通過人工方法處理微生物促使其發(fā)生突變并運用合理的篩選程序和方法，把適合人類需要的優(yōu)良菌株進(jìn)行選育處理的過程，它可大大提高微生物突變率，是十分重要的育種手段。誘變育種的主要步驟分為出發(fā)菌株的誘變處理和突變株的篩選兩大部分。出發(fā)菌株的誘變處理包括出發(fā)菌株的選擇、誘變劑的選擇和誘變劑量的確定。在出發(fā)菌株的選擇上盡量選擇經(jīng)多次自發(fā)或誘變突變且每次誘變都有較好效果的菌株作為出發(fā)菌株，誘變劑的選擇原則是使用方便并行之有效，并選擇既能擴(kuò)大變異幅度，又能促進(jìn)正突變的劑量。突變體的篩選主要通過科學(xué)的初篩和復(fù)篩方法來選擇正突變株。

高產(chǎn)酸性蛋白酶菌種的選育是國內(nèi)外研究的熱點。目前報道的菌種選育方法主要是傳統(tǒng)的化學(xué)誘變方法（亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等）和物理誘變方法相結(jié)合，這樣的誘變方法，效率較低，產(chǎn)量提高的幅度也不大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株選育方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：

一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株選育方法，包括以下步驟：

a）孢子懸浮液制備：取恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)35℃下培養(yǎng)8d的平板孢子，用無菌蒸餾水洗脫平板孢子，置于無菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250～400r/min的震蕩裝置上震蕩6～10h，使孢子活化和分散，孢子分散率在95%以上，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子并計數(shù)，然后用無菌蒸餾水稀釋孢子懸浮液至126個/mL，即得孢子懸浮液并備用；

b）紫外線誘變：取5mL步驟a）制備得到的孢子懸浮液加入直徑為9cm平皿，將平皿置于距40W紫外燈25cm處的磁力攪拌器上，照射時間為35～40min，稀釋并取0.1mL孢子懸浮液涂布于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板，整個過程均在紅光下進(jìn)行，然后在35℃避光條件下培養(yǎng)90h，最后根據(jù)平皿菌落數(shù)計算致死率；

c）菌株篩選：

c1)以步驟b中致死率為70%～80%的菌株為基礎(chǔ)，挑選其中HC值大于平均值的變異菌株作為初篩菌株，以備復(fù)篩，HC值=透明圈直徑/菌落直徑；

c2)取步驟c1)得到的菌株，接種于含60mL液體土豆培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，在35℃下300r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)90h，通過福林酚法測定酸性蛋白酶酶活力；選取誘變后得到的酶活力大于平均值的變異菌株連續(xù)傳代6次，得到高產(chǎn)菌株。

作為優(yōu)選，所述的步驟a）中的震蕩裝置為落地式大容量恒溫震蕩搖床，震蕩速度為250r/min，震蕩時間為8h。

作為優(yōu)選，所述的步驟b）中的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基由糖度為5～6°Brix的過濾麥芽汁添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂，然后調(diào)pH值為6.0，并在0.2MPa壓力下滅菌40min后制備得到。

作為優(yōu)選，所述步驟b）中避光條件下培養(yǎng)時，為避免光復(fù)活效應(yīng)，麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板采用黑布進(jìn)行遮掩。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：它具有操作方便、價格低廉、設(shè)備簡單、誘變頻效率高且不容易發(fā)生回復(fù)突變，迄今為止仍是微生物育種中最常用和有效的誘變方法。其誘變機(jī)制如下：紫外線可以使DNA雙鏈之間或者同一條鏈上的兩個相鄰的胸腺嘧啶形成嘧啶二聚體，這個二聚體會阻礙雙鏈的解開，以致影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，嘧啶二聚體的形成，還會減弱胸腺嘧啶雙鍵間氫鍵的作用，引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，導(dǎo)致它阻礙堿基的正常配對，從而有可能引起微生物突變或死亡提高育種過程的變異頻率，加快育種進(jìn)程，得到的突變株是比原始菌株更優(yōu)秀的穩(wěn)定高產(chǎn)、高含量的新菌株，可以很大程度上提高菌株的發(fā)酵能力，是個簡單易行便捷的好方法。

附圖說明

以下結(jié)合附圖和本發(fā)明的實施方式來作進(jìn)一步詳細(xì)說明

圖1為本發(fā)明提供的紫外線照射致死率曲線；

圖2為本發(fā)明提供的紫外線照射劑量對突變率的影響。

具體實施方式

本實施例中采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株選育方法，包括以下步驟：