[發明專利]一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法

在審

• 申請號: 201610351278.2
• 申請日: 2016-05-25
• 公開（公告）號: CN105779431A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 何榮軍;王茜;孫培龍
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N1/02
• 代理公司: 杭州之江專利事務所(普通合伙) 33216
• 代理人: 朱楓

1.一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于：包括以下步驟：

a）孢子懸浮液制備：取恒溫培養箱內35℃下培養8d的平板孢子，用無菌蒸餾水洗脫平板孢子，置于無菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250～400r/min的震蕩裝置上震蕩6～10h，使孢子活化和分散，孢子分散率在95%以上，在光學顯微鏡下觀察孢子并計數，然后用無菌蒸餾水稀釋孢子懸浮液至126個/mL，即得孢子懸浮液并備用；

b）紫外線誘變：取5mL步驟a）制備得到的孢子懸浮液加入直徑為9cm平皿，將平皿置于距40W紫外燈25cm處的磁力攪拌器上，照射時間為35～40min，稀釋并取0.1mL孢子懸浮液涂布于麥芽汁瓊脂培養基平板，整個過程均在紅光下進行，然后在35℃避光條件下培養90h，最后根據平皿菌落數計算致死率；

c）菌株篩選：

c1)以步驟b中致死率為70%～80%的菌株為基礎，挑選其中HC值大于平均值的變異菌株作為初篩菌株，以備復篩，HC值=透明圈直徑/菌落直徑；

c2)取步驟c1)得到的菌株，接種于含60mL液體土豆培養基的錐形瓶內，在35℃下300r/min的搖床內培養90h，通過福林酚法測定酸性蛋白酶酶活力；選取誘變后得到的酶活力大于平均值的變異菌株連續傳代6次，得到高產菌株。

2.如權利要求1所述的一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于：所述的步驟a）中的震蕩裝置為落地式大容量恒溫震蕩搖床，震蕩速度為250r/min，震蕩時間為8h。

3.如權利要求1所述的一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于：所述的步驟b）中的麥芽汁瓊脂培養基由糖度為5～6°Brix的過濾麥芽汁添加質量分數為2%的瓊脂，然后調pH值為6.0，并在0.2MPa壓力下滅菌40min后制備得到。

4.如權利要求1所述的一種采用紫外線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于：所述步驟b）中避光條件下培養時，為避免光復活效應，麥芽汁瓊脂培養基平板采用黑布進行遮掩。