[發明專利]一種噬菌體輔助的多細菌連續定向進化系統和方法

有效

• 申請號: 201610349254.3
• 申請日: 2016-05-24
• 公開（公告）號: CN107418964B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 劉陳立;賴旺生;魏婷;趙國屏
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/73
• 分類號: C12N15/73;C12N1/21
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 曹衛良

本發明公開了一種噬菌體輔助的多細菌連續定向進化系統和方法，該系統中包含攜帶待進化目的基因的噬菌體SM，支持進化前后不同SM增殖的多種輔助質粒HP和誘導突變的質粒IP。不同HP被放置在不同宿主菌中，可以有效提高噬菌體的增殖與進化效率，同時避免不同基因元件間的相互干擾，具有較好的實用性，可以用于多種基因的定向進化。

技術領域

本發明涉及生物進化領域，尤其涉及一種噬菌體輔助的多細菌連續定向進化系統和方法。

背景技術

定向進化(也稱實驗室進化)是一種強有力的技術方法，它可以通過駕馭生物進化過程，產生具有指定功能的生物分子。所產生的生物分子已廣泛應用于工業生產、生物工程、醫藥開發等諸多領域。哈佛大學David R Liu實驗室開發了一種基于噬菌體生長的連續進化系統(噬菌體輔助持續進化，PACE)。它主要包含SM、HP、IP三個模塊：噬菌體模塊(SM)：噬菌體M13基因中包裝以及侵染宿主菌所需的gIII基因被切除，插入待進化生物分子的基因，其中噬菌體缺少gIII后，無法侵染宿主產生子代噬菌體；誘變模塊(IP)：利用阿拉伯糖作為誘導物誘導DNAQ926、dam和seqA表達，使DNA復制過程中聚合酶引入的錯誤堿基不能被切除，提高突變率，由阿拉伯糖誘導的IP使噬菌體的突變速率提高幾百倍；輔助模塊(HP)：含有噬菌體侵染宿主細胞進行繁殖所需的gIII基因，通過將HP上gIII的表達與SM上待進化目的基因的生物活性綁定在一起(比如要使某RNA聚合酶向特定方向進化，則利用與進化方向一致的啟動子來控制gIII的表達)，來決定各突變SM能否產生具有感染活性的子代噬菌體SM。本發明中，SM或其突變株能(或不能)啟動gIII基因表達指的就是SM或其突變株上的待進化目的基因能(或不能)啟動gIII基因表達。

在進化池中，攜帶待進化野生型目的基因的噬菌體侵染宿主細胞時，將其遺傳物質野生型SM注入宿主菌，利用宿主菌內的復制系統進行遺傳物質的復制。與此同時，在阿拉伯糖的誘導下，宿主細胞內IP上的DNAQ926、dam和seqA表達，導致SM產生突變。若SM獲得的突變(即SM上目的基因突變)可以啟動gIII蛋白的表達，則可以產生具有侵染性的子代噬菌體。這些新產生的子代噬菌體突變株SMe分泌到宿主菌外，去感染新的宿主菌，進行下一輪復制增殖。由此那些能夠啟動gIII表達的SMe突變株就可以不斷地增殖，提高自身數量，而那些野生型的SM和不能啟動gIII表達的突變SM則不能分泌子代噬菌體進行增殖，其數量不會提高。這時如果以一定的速度向進化池中不斷添加新的宿主菌培養物并排出舊培養物，則那些不能啟動gIII表達或者表達能力低的野生型SM及其突變株很快就會被洗脫出去，而那些可以高效啟動gIII表達的SMe突變株則最終會被保留下來。

由于只有進化后的SMe能夠啟動gIII表達并進行增殖，初始的野生型SM則不能，它會被直接洗脫掉。但SM的進化與篩選需要在SM的增殖過程中才能進行，所以在這種情況下，SM的進化效率變的極低。針對這種情況的一個解決方案是，向宿主菌中引入兩個輔助模塊HP1(或HP1.1)、HP2。HP1上的gIII可以直接被野生型SM啟動表達，HP2上的gIII則只能被進化后SMe啟動gIII表達。這樣野生型SM可以通過啟動HP1上的gIII表達來支持自身的增殖，并在增殖過程中進行突變進化，從而進化出能夠啟動HP2上的gIII表達的SMe。得到的SMe可以通過其他途徑進行下一步的進化篩選。

在實際應用中，這種野生型SM所識別啟動的HP1和被進化后的SMe所識別啟動的HP2同時存在于一個宿主菌中的進化系統使用效果并不理想。HP1和HP2在功能、表達方式上相似度很高。它們同時出現在一個宿主菌中時，會出現嚴重的相互干擾現象。這時經常會出現初始加入的野生型SM對HP1和HP2上的gIII基因表達的啟動效果變得都很低，甚至出現HP1和HP2上的gIII均難以被啟動表達的現象，從而使得定向進化難以進行。

發明內容