[發明專利]一種噬菌體輔助的多細菌連續定向進化系統和方法

有效

• 申請號: 201610349254.3
• 申請日: 2016-05-24
• 公開（公告）號: CN107418964B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 劉陳立;賴旺生;魏婷;趙國屏
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/73
• 分類號: C12N15/73;C12N1/21
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 曹衛良

1.一種噬菌體輔助的多細菌連續定向進化系統，其特征在于，所述系統包括攜帶待進化目的基因的噬菌體SM，以及宿主菌，其中所述噬菌體SM具有增殖缺陷；

所述系統中宿主菌包含兩株以上支持噬菌體增殖和進化的宿主菌，其功能通過攜帶相應基因元件來實現，所述宿主菌為攜帶F因子的大腸桿菌；

所述宿主菌在攜帶相應基因元件前是所述噬菌體SM的非缺陷株的天然宿主菌或者該天然宿主菌經過遺傳改造后獲得的菌株，或者是經過遺傳改造后才獲得易感性的非天然宿主菌；

所述系統中宿主菌包括宿主菌S1和宿主菌S2；所述宿主菌S1包含支持進化前SM增殖的輔助質粒HP1和誘導突變的質粒IP，所述宿主菌S2包含支持進化后SM增殖的輔助質粒HP2和誘導突變的質粒IP；進化前的目的基因的功能與HP1上支持進化前SM增殖的基因元件的功能關聯，進化后的目的基因的功能至少部分與HP2上支持進化后SM增殖的基因元件的功能關聯；

系統所述噬菌體SM為M13噬菌體，其中包裝及侵染宿主菌所需的gIII基因被切除；相應地，所述輔助質粒包含所述gIII基因；

所述誘導突變的質粒IP包含誘變基因，所述誘變基因由第12和14位氨基酸被突變為Ala的DNAQ基因突變體DNAQ926基因、脫氧腺苷甲基化酶dam基因、半甲基化GATC結合蛋白seqA基因組成，能夠提高遺傳信息在復制和轉錄等傳遞過程中的突變率。

2.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述系統還包括宿主菌S3，所述宿主菌S3包含支持進化后SM增殖的輔助質粒HP2和誘導突變的質粒IP，以及輔助質粒HP3，該HP3上的基因元件的功能與進化前的目的基因的功能關聯，同時HP3具有功能缺陷，不能支持進化前SM增殖。

3.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述目的基因是任何一種或幾種蛋白編碼基因和非編碼基因。

4.根據權利要求3所述的系統，其特征在于，所述目的基因選自T7RNA聚合酶基因、蛋白酶基因、纖維素酶基因、熒光蛋白基因、密度感應基因中的一種或幾種。

5.一種噬菌體輔助的多細菌連續定向進化方法，其特征在于，所述方法包括：在誘導劑的存在下，使攜帶待進化目的基因的噬菌體SM在含有宿主菌S1和S2的培養體系中進行增殖，直至產生攜帶進化后的目的基因的噬菌體SMe；其中所述噬菌體SM具有增殖缺陷，所述宿主菌S1包含支持進化前SM增殖的輔助質粒HP1和誘導突變的質粒IP，所述宿主菌S2包含支持進化后SM增殖的輔助質粒HP2和誘導突變的質粒IP；進化前的目的基因的功能與HP1上支持進化前SM增殖的基因元件的功能關聯，進化后的目的基因的功能至少部分與HP2上支持進化后SM增殖的基因元件的功能關聯；

系統所述噬菌體SM為M13噬菌體，其中包裝及侵染宿主菌所需的gIII基因被切除；相應地，所述輔助質粒包含所述gIII基因；

所述宿主菌為攜帶F因子的大腸桿菌；

所述方法還包括：不斷添加新的宿主菌培養物并排出舊的培養物。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：在誘導劑的存在下，使攜帶進化后的目的基因的噬菌體SMe在含有宿主菌S3和S2的培養體系中進行增殖，直至產生攜帶更進一步進化后的目的基因的噬菌體SMeN，其中所述宿主菌S3包含支持進化后SM增殖的輔助質粒HP2和誘導突變的質粒IP，以及輔助質粒HP3，該HP3上的基因元件的功能與進化前的目的基因的功能關聯，同時HP3具有功能缺陷，不能支持進化前SM增殖。

7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：通過噬菌斑計數或者報告基因實時監測以顯示目的基因活性和噬菌體的增殖活性。

8.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述目的基因是任何一種或幾種蛋白編碼基因和非編碼基因。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述目的基因選自T7RNA聚合酶基因、蛋白酶基因、纖維素酶基因、熒光蛋白基因、密度感應基因中的一種或幾種。