[發明專利]一種基于DSE快速擴繁建立DSE-植物共生體系的方法

有效

• 申請號: 201610338525.5
• 申請日: 2016-05-20
• 公開（公告）號: CN105918127B
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發明（設計）人: 徐舟影;班宜輝;張世羊
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N1/14
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司42102
• 代理人: 鐘鋒,徐曉琴

技術領域

本發明屬于微生物學、植物營養和生態學領域，具體涉及一種基于DSE快速擴繁建立DSE-植物共生體系的方法。

背景技術

深色有隔內生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)是指能夠廣泛地存在于植物根的表皮、皮層甚至維管束組織的細胞內或細胞間隙、分類學上比較混雜的一類共生真菌，菌絲呈現棕色或深色且有隔膜，能夠在植物細胞內或細胞間隙形成“微菌核(microsclerotia)”結構。DSE被認為具有類似菌根的功能，且和叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)相比，這類共生真菌能夠在干旱、寒冷和重金屬污染地區等環境中廣泛分布，并且對提高逆境下宿主植物的耐受性發揮重要作用。

目前，對DSE的研究越來越受到重視，如何用較短的時間，高效率的獲得DSE-植物共生苗成為DSE研究中的關鍵技術之一。而目前常用的DSE-植物共生體系的建立方法是在植物幼苗的固態培養基質或培養液中直接接種DSE的菌餅(或菌塊)。然而，新接入的菌餅(或菌塊)上的DSE菌絲一般很難直接侵入植物根系，通常需要一定時間的生長和繁殖，而植物培養環境及營養條件并不利于DSE生長，因此這種方法下DSE-植物共生體系建立時間較長，也增加了雜菌污染的幾率，成功率低。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種基于DSE快速擴繁建立DSE-植物共生體系的方法。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種基于DSE快速擴繁建立DSE-植物共生體系的方法，包括如下步驟：

(1)DSE快速擴繁：將DSE菌株接種到PDA培養基上，置于25℃培養箱內暗培養活化2周，用Φ5mm打孔器沿菌落邊緣打取DSE菌餅；將DSE菌餅接種至擴繁培養基中，混合均勻，置于25℃培養箱內暗培養2周，每隔48h搖瓶振蕩一次；采用稀釋平板法檢測DSE有效繁殖體數量，當DSE有效繁殖體數量達到≥50CFU/g時即得到DSE接種劑，備用；

(2)無菌植物幼苗的培養：將種子用70％乙醇消毒50s，用0.1％HgCl₂消毒7min，然后用無菌水沖洗3次，將消毒后的種子轉移到含有MS固體培養基的培養瓶中25℃培養，待種子萌發形成幼苗時，挑選生長一致的幼苗作為無菌植物幼苗，備用；

(3)DSE-植物共生體系的建立：將DSE接種劑接種至共生培養基中，充分混合后再接入無菌植物幼苗，用無菌的PVA膜封口，置于光照培養箱內培養2周；

(4)DSE-植物共生體系的檢測：2周后，將植物幼苗從共生培養培養瓶中取出，用蒸餾水沖洗根系，放入10％KOH溶液中，90℃水浴條件下解離30min，然后經1％鹽酸酸化、0.05％曲利苯藍染色、乳酸甘油脫色后于顯微鏡下鏡檢觀察根系中DSE的定殖情況，當部分根段看到DSE的深色或藍色有隔菌絲和典型特征“微菌核”時，表明DSE-植物共生體系建立成功。

上述方案中，步驟(1)所述擴繁培養基包括改進的MMN培養液和培養基質，所述培養基質為蛭石、珍珠巖、豆粕和麩皮按照體積比為3：2：1：1的比例混合而成的混合物，所述改進的MMN培養液和培養基質的體積比為2：5。

上述方案中，所述改進的MMN培養液為：葡萄糖15g，麥芽浸粉15g，CaCl₂ 0.05g/L，MgSO₄ 0.15g，NaCl 0.025g，FeCl₃(1％)1.2mL，KH₂PO₄ 0.5g，硫胺素100μg，(NH₄)₂HPO₄0.25g，檸檬酸0.2g，蒸餾水1000mL，pH 5.5。

上述方案中，步驟(3)所述共生培養基包括MS培養基和蛭石，所述MS培養基和蛭石的質量比為3：10。

上述方案中，步驟(3)所述光照培養箱內培養的條件為：溫度25℃、光照14h/d、光照強度1000～8000Lux。