[發明專利]一種基于DSE快速擴繁建立DSE-植物共生體系的方法

有效

• 申請號: 201610338525.5
• 申請日: 2016-05-20
• 公開（公告）號: CN105918127B
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發明（設計）人: 徐舟影;班宜輝;張世羊
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N1/14
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司42102
• 代理人: 鐘鋒,徐曉琴

1.一種基于DSE快速擴繁建立DSE-植物共生體系的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）DSE快速擴繁：將DSE菌株接種到PDA培養基上，置于25℃培養箱內暗培養活化2周，用Φ5 mm打孔器沿菌落邊緣打取DSE菌餅；將DSE菌餅接種至擴繁培養基中，混合均勻，置于25℃培養箱內暗培養2周，每隔48 h搖瓶振蕩一次；采用稀釋平板法檢測DSE有效繁殖體數量，當DSE有效繁殖體數量≥50 CFU/g 時即得到DSE接種劑，備用；所述擴繁培養基包括改進的MMN培養液和培養基質，所述培養基質為蛭石、珍珠巖、豆粕和麩皮按照體積比為3：2：1：1的比例混合而成的混合物，所述改進的MMN培養液和培養基質的體積比為2：5；所述改進的MMN培養液為：葡萄糖15 g，麥芽浸粉15 g，CaCl₂ 0.05 g，MgSO₄ 0.15 g，NaCl 0.025 g，FeCl₃ 1wt%、1.2 mL，KH₂PO₄ 0.5 g，硫胺素100 μg，(NH₄)₂HPO₄ 0.25 g，檸檬酸0.2 g，蒸餾水1000 mL，pH 5.5；

（2）無菌植物幼苗的培養：將種子用70％乙醇消毒50 s，用0.1%HgCl₂消毒7 min，然后用無菌水沖洗3次，將消毒后的種子轉移到含有MS固體培養基的培養瓶中25℃培養，待種子萌發形成幼苗時，挑選生長一致的幼苗作為無菌植物幼苗，備用；

（3）DSE-植物共生體系的建立：將DSE接種劑接種至共生培養基中，充分混合后再接入無菌植物幼苗，用無菌的PVA膜封口，置于光照培養箱內培養2周；所述共生培養基包括MS培養基和蛭石，所述MS培養基和蛭石的質量比為3：10；

（4）DSE-植物共生體系的檢測：2周后，將植物幼苗從共生培養培養瓶中取出，用蒸餾水沖洗根系，放入10% KOH溶液中，90℃水浴條件下解離30 min，然后經1%鹽酸酸化、0.05%曲利苯藍染色、乳酸甘油脫色后于顯微鏡下鏡檢觀察根系中DSE的定殖情況，當部分根段看到DSE的深色或藍色有隔菌絲和典型特征“微菌核”時，表明 DSE-植物共生體系建立成功。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3）所述光照培養箱內培養的條件為：溫度 25℃、光照14 h/d、光照強度1000~8000 Lux。