[發明專利]GBA基因L444P突變檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610332857.2
• 申請日: 2016-05-19
• 公開（公告）號: CN105755166A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 謝勇壯;郭奇偉;鐘力;許華曦;卜國軍;曹甜甜
• 申請（專利權）人: 廈門人瑞生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及基因突變檢測，尤其是涉及一種GBA基因L444P突變檢測試劑盒。

背景技術

戈謝病是一種常染色體隱性遺傳引起的溶酶體貯積病。由于葡糖腦苷脂酶GBA基因突變，葡糖腦苷脂酶活性降低或喪失，造成葡糖腦苷脂在巨噬細胞內貯積，臨床上以肝脾腫大、貧血、血小板減少、骨骼破壞、生長發育落后、反復癲癇發作和共濟失調為主。戈謝病在世界各地廣泛流行，其發病率為1/(10～40)萬。GBA是位于1號染色體上，目前將近有300個不同的突變被報道，其中N370S、L444P突變是最常見的基因突變類型。

許多研究在散發性帕金森病(PD)上也發現GBA基因的突變。帕金森病是除了阿爾茨海默病(AD)以外的第二常見的神經退行性疾病。在我國65歲以上人群中的PD患病率為1.17％，與歐美發達國家相似，這一比例在75歲以上的人群中上升到3％，因此帕金森病已成為我國現代社會嚴重危害人類健康的重大疾病之一。

帕金森病確診的時間平均是在70歲，但是其癥狀卻比臨床確診更早的出現，因此尋找早期帕金森病生物學標志以及進行基因診斷，對于其風險預測以及后期預防極為重要。帕金森病從確診到死亡一般會持續15年，有些可以活到20年甚至更久。目前關于它的發病原因和確切的發病機制還不是十分清楚，但普遍認為此病是由遺傳、環境和老化相互作用導致的復雜性疾病。帕金森病的發病與遺傳基因的突變密切相關，研究通過對家族性帕金森病病例的分析，在染色體上已發現至少有13個位點與家族性帕金森病相關。其中在中國人群中LRRK2和GBA基因突變最為常見。許多研究也表明GBA的突變會增加7～10倍的帕金森病風險。

2004年，Lwin等(LwinA,OrviskyE,Goker-AlpanO，etc.Glucocerebrosidasemutationsinsubjectswithparkinsonism.MolGenetMetab.2004Jan；81(1):70-3.)首先研究GBA基因在帕金森病中的可能作用，結果顯示在帕金森病病人中GBA基因突變率高達21％；而對照組中GBA基因突變率僅為4.45％。這一結果提示GBA基因突變很可能是帕金森病的一種危險因素。GBA基因突變在人群中有所差異，有報道在中國人群中GBAL444P(1448T>C)突變與PD相關(WangY,LiuL,XiongJ,etc.GlucocerebrosidaseL444PmutationconfersgeneticriskforParkinson'sdiseaseincentralChina.BehavBrainFunct.2012Dec10；8:57.)。在中國大陸402例散發性帕金森病患者中發現11例攜帶GBA基因L444P突變，均為雜合突變(SunQY,GuoJF,WangL,etc.GlucocerebrosidasegeneL444PmutationisariskfactorforParkinson'sdiseaseinChinesepopulation.MovDisord.2010Jun15；25(8):1005-11.)。在413名健康對照者中未發現GBA基因L444P突變，因此GBA基因L444P突變是中國人群PD的危險因素之一。

因此，臨床上對PD風險基因GBA的444位點進行檢測，檢測受測者是否攜帶相關基因突變，可以協助醫生診斷帕金森病，以便更及時地指導用藥，大大減輕病人和家屬的負擔。對帕金森風險基因進行檢測有助于風險基因攜帶的受測者提早對帕金森病進行預防和治療，起到早檢測早預防的作用。

目前應用于帕金森相關風險基因檢測的技術主要是聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態性(PCR-RFLP)法。該方法是根據GBA基因L444P突變位點的不同選擇了一種限制性內切酶，該種內切酶只對其中的一種多態性具有切割的作用，而對另一種多態性不會產生切割。這種方法首先通過引物對GBA基因L444P突變位點進行PCR反應，然后對PCR產物使用限制性內切酶進行酶切反應，再把酶切產物進行電泳分析，根據所得到的片斷大小來對GBA基因L444P多態性位點進行分析。該方法存在諸多的不足。首先，該方法依靠限制性內切酶的活性，在酶切過程中容易產生假陽性和假陰性的結果；其次，電泳的方法容易造成致命的PCR產物污染，導致結果的誤判；再次，該方法費時(約5～6h)，耗工，至少包括PCR擴增、酶切、電泳、凝膠成像分析四個步驟，需要大量人工操作，自動化程度低，人為誤差大。