[發(fā)明專利]一種用于制備依折麥布中間體的固定化酶及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610332445.9
• 申請日: 2016-05-19
• 公開（公告）號: CN105754983B
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮文亮;王靜
• 申請（專利權(quán)）人: 河北周酶生物科技有限公司
• 主分類號: C12N11/02
• 分類號: C12N11/02;C12P17/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種采用固定化酶制備依折麥布中間體的方法，其特征在于：以(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-惡唑烷酮為底物，使該底物在固定化酶、輔酶、氫供體和酶活力增強劑的存在下在溶劑中發(fā)生不對稱還原反應(yīng)生成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羥基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮雜環(huán)戊烷-2-酮，具體步驟為：在反應(yīng)容器中加入溶劑，再依次加入底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-惡唑烷酮，氫供體，固定化酶、輔酶和酶活力增強劑，于溫度20℃~35℃下攪拌反應(yīng)，利用高效液相色譜監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，至轉(zhuǎn)化率達到99.8%以上終止反應(yīng)，反應(yīng)時間6~18h，其中，所述的輔酶選自NAD或NADP，所述氫供體選自異丙醇或葡萄糖/葡萄糖脫氫酶組合物，所述酶活力增強劑為二價金屬離子，所述溶劑為pH值為6.0~7.5的水相緩沖液，反應(yīng)起始時反應(yīng)體系中所述(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-惡唑烷酮的濃度為8%~20%，固定化酶的濃度為5%~15%，輔酶NAD或NADP的濃度為0.005%~0.04%，所述二價金屬離子的濃度為0.5~3mM，所述二價金屬離子以鹽酸鹽、硫酸鹽的形式存在，當(dāng)氫供體為異丙醇時，異丙醇的體積百分濃度為8%~15%，當(dāng)氫供體為葡萄糖/葡萄糖脫氫酶組合物時，葡萄糖的濃度為5%~15%，葡萄糖脫氫酶0.005%~0.03%，除二價金屬離子和異丙醇外，其他所述濃度是指質(zhì)量體積比濃度（w/v），單位為g/mL；

所述固定化酶由酮基還原酶或羰基還原酶以共價結(jié)合的固定方式固定于固定化酶載體中制備而成，所述固定化酶載體選自環(huán)氧基固定化酶載體或氨基固定化酶載體，其中，所述酮基還原酶或羰基還原酶占所述固定化酶載體的質(zhì)量百分比為0.01%~5%，所述共價結(jié)合的固定方式的步驟為：將酮基還原酶或羰基還原酶和固定化酶載體分別加入緩沖溶液中，控制固定化反應(yīng)溫度為15~40℃，攪拌反應(yīng)8~96小時，收集固體，干燥，即得，其中，所述緩沖溶液的pH值為5~10，所述緩沖溶液選自磷酸鹽緩沖溶液、Tris-HCL緩沖溶液或三乙醇胺緩沖溶液。

2.如權(quán)利要求1所述的采用固定化酶制備依折麥布中間體的方法，其特征在于：所述酮基還原酶或羰基還原酶占所述固定化酶載體的質(zhì)量百分比為0.1%~2%。

3.如權(quán)利要求1所述的采用固定化酶制備依折麥布中間體的方法，其特征在于：所述共價結(jié)合的固定方式的步驟中，所述固定化反應(yīng)溫度為25℃，所述緩沖溶液pH為8，所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液。

4.如權(quán)利要求1所述的采用固定化酶制備依折麥布中間體的方法，其特征在于：所述水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCL緩沖液。

5.如權(quán)利要求1所述的采用固定化酶制備依折麥布中間體的方法，其特征在于：所述二價金屬離子為錳離子或鎂離子。

6.如權(quán)利要求5所述的采用固定化酶制備依折麥布中間體的方法，其特征在于：所述二價金屬離子以氯化錳或氯化鎂形式加入。