[發明專利]一種檢測廣譜支原體的LAMP引物組、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201610325986.9
• 申請日: 2016-05-16
• 公開（公告）號: CN105755161A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 曹振
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測廣譜支原體的LAMP引物組、試劑盒及其應用。

背景技術

哺乳動物細胞的培養過程中，支原體(Mycoplasma)污染歷來是一個令人頭疼的問題，主要原因有三點：1)、支原體體積非常小，直徑為0.1μm，一般過濾除菌無法去除，光學顯微鏡下難以看清它的形態結構；2)、支原體生命力頑強，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，且對青霉素有抗藥性；3)、細胞受支原體污染初期，部分敏感細胞可見細胞生長增值變慢、形態變圓。但多數細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產生交叉污染。支原體最終會導致細胞死亡，不過更常見的情況是，支原體與細胞共存。在這過程當中，支原體慢慢增殖，直至對細胞產生明顯的影響，如干擾細胞遷移、信號轉導、淋巴細胞活化和細胞因子表達。對于相關科研工作者來說，最可怕的是支原體污染在不知不覺中改變許多參數，使研究成果的可信度大打折扣。

常用的支原體檢測手段包括傳統的培養法、ELISA法、PCR法等，這些方法都有不同程度的優缺點。目前PCR法是主流的支原體檢測方法，但該技術有五個明顯的缺點，1)、需要多個反應溫度，整個過程必須要有精確控制溫度的熱循環儀；2)、PCR擴增只需要兩條引物，經常會出現非特異性擴增；3)、細胞生長的代謝物質會抑制PCR反應，直接用細胞培養上清進行支原體檢測，往往產生假陰性結果；4)PCR法靈敏度低，通常需要離心富集支原體或先提取基因組DNA；5)結果需要通過電泳來確認，過程繁瑣。

為克服PCR的上述缺點，近十幾年來開發了多種核酸等溫擴增技術。其中Notomi在2000年開發的環介導等溫核酸擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是眾多等溫擴增技術中的翹楚，它具有明顯的優勢：首先整個擴增過程只需要使用一個溫度，無需精確控溫的熱循環儀，只需一個水浴鍋即可完成。其次，擴增需要使用多個引物，使得此方法的檢測特異性顯著提高。最后，可通過特殊的染料肉眼觀察檢測結果。

LAMP可以檢測細菌、真菌等病原微生物，并具有很好的特異性和靈敏度。但目前尚無基于顏色判定的LAMP廣譜支原體檢測的相關應用。

發明內容

為了克服現有技術的上述缺陷，本發明提供了一種檢測廣譜支原體的LAMP引物組及一種支原體可視化檢測試劑盒。其具體技術方案如下：

本發明提供了一種檢測廣譜支原體的LAMP引物組，由外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF和環引物LB組成，外引物F3如SEQIDNO.1所示，外引物B3如SEQIDNO.2所示，內引物FIP如SEQIDNO.3所示，內引物BIP如SEQIDNO.4所示，環引物LF如SEQIDNO.5所示，環引物LB如SEQIDNO.6所示。

進一步地，上述外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF和環引物LB的摩爾比為1:1:8:8:2:2。

本發明還提供了一種含有上述LAMP引物組的支原體可視化檢測試劑盒。

進一步地，上述試劑盒還包括變色指示劑、BstDNA聚合酶、dNTPs、甜菜堿、等溫擴增緩沖液和MgSO₄。

更進一步地，上述變色指示劑為羥基萘酚藍。

進一步地，外引物F3在支原體可視化檢測試劑盒的LAMP反應液中的終濃度為0.2μM，外引物B3在支原體可視化檢測試劑盒的LAMP反應液中的終濃度為0.2μM，內引物FIP在支原體可視化檢測試劑盒的LAMP反應液中的終濃度為1.6μM，內引物BIP在支原體可視化檢測試劑盒的LAMP反應液中的終濃度為1.6μM，環引物LF在支原體可視化檢測試劑盒的LAMP反應液中的終濃度為0.4μM，環引物LB在支原體可視化檢測試劑盒的LAMP反應液中的終濃度為0.4μM。

進一步地，上述試劑盒還包括陽性模板。

更進一步地，上述陽性模板為含有豬鼻支原體23srRNA5’端部分基因片段的質粒。

本發明還提供了上述LAMP引物組或支原體可視化檢測試劑盒在檢測支原體污染中的應用。