[發明專利]基于量子點熒光免疫檢測DNMT1的方法

有效

• 申請號: 201610324656.8
• 申請日: 2016-05-17
• 公開（公告）號: CN105842451B
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 吳擁軍;劉利娥;熊亞敏;玉崧成;于斐;何磊良;屈凌波;王華棟
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州德勤知識產權代理有限公司41128
• 代理人: 黃軍委,白毅明

技術領域

本發明涉及檢測技術領域，具體的說，涉及了一種基于量子點熒光免疫檢測DNMT1的方法。

背景技術

在檢測領域中，常常需要對各類抗原或抗體進行定性或定量檢測。現有技術中，已經以“雙抗夾心”為基礎衍生出多種免疫反應分析方法，如：放射免疫法、酶聯免疫法、化學發光法、時間分辨熒光法和熒光免疫法等，可用于確定病原微生物，對人體的特異性蛋白定量檢測從而對疾病進行輔助診斷或監測等等，用途非常廣泛。這類免疫反應分析方法的通常作法是：將捕獲抗體固定于固相載體，然后與抗原(目標蛋白)反應，洗滌后再與標記抗體反應，洗滌，加入底物檢測光信號或直接檢測熒光信號。雖然上述方法的自動化免去了人工洗滌的煩瑣，但存在固相載體的分離效率較低、檢測精度不高等缺點。

為了解決以上存在的問題，人們一直在尋求一種理想的技術解決方案。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，從而提供一種以納米固相顆粒為載體，具有分離效率高、檢測精度高且具有高度特異性的基于量子點熒光免疫檢測DNMT1的方法。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：一種基于量子點熒光免疫檢測DNMT1的方法，具體步驟包括：

提供一種表面被DNMT1單克隆抗體共價修飾的Fe₃O₄納米免疫磁性顆粒懸浮液，記作為Fe₃O₄@McAb；

提供一種表面被量子點標記的DNMT1多克隆抗體，記作為QDs@PcAb；

將經CB緩沖液稀釋后的所述Fe₃O₄@McAb與經PBS緩沖液稀釋后的DNMT1標準樣或待測目標物進行溫育反應50 min～60 min，使得所述DNMT1標準樣或待測目標物被Fe₃O₄@McAb捕獲、富集分離；

然后將經PBST緩沖液稀釋后的所述QDs@PcAb與被Fe₃O₄@McAb捕獲、富集分離的所述DNMT1標準樣或待測目標物進行溫育反應110 min～130 min，使得所述QDs@PcAb與所述DNMT1標準樣或待測目標物相結合；經PBST緩沖液稀釋后，在多功能微孔板讀數儀上測定270 nm激發下反應產物的熒光強度；

根據檢測的熒光強度與所述DNMT1標準樣或待測目標物濃度之間的關系，分段建立檢測DNMT1的回歸方程。

需要說明的是，上述各步驟中，CB代表碳酸鹽緩沖液、PBS代表磷酸鹽緩沖溶液、PBST代表添加Tween-20非離子表面活性劑的磷酸鹽緩沖溶液。

基于上述，所述基于量子點熒光免疫檢測DNMT1的方法，還包括采用ELISA法檢測提供的所述Fe₃O₄@McAb的生物活性的步驟。

基于上述，提供一種所述Fe₃O₄@McAb的步驟包括：

（1）清洗：將Fe₃O₄納米顆粒懸浮液經超聲、磁分離棄上清處理后采用濃度為0.01 mol/L～0.015 mol/L、pH為6.0的MES緩沖液對其平衡2 min～5 min，然后進行磁分離棄上清得到第一沉淀物。其中MES代表嗎啉乙磺酸緩沖液；

（2）活化：向所述第一沉淀物中依次加入濃度為8 mg/mL～10 mg/mL EDC溶液和濃度為8 mg/mL～11 mg/mL NHS溶液進行渦旋反應10 min～15 min，磁分離、棄上清處理后采用MES緩沖液對其洗滌3次，然后再進行磁分離、棄上清處理得到第二沉淀物。其中，EDC代表(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液、NHS代表N-羥基琥珀酰亞胺溶液、MES代表嗎啉乙磺酸緩沖液、mg/mL代表毫克每毫升；

（3）緩沖體系轉換：采用PBS緩沖液對所述第二沉淀物洗滌3～4次次，磁分離得到第三沉淀物；

（4）偶聯：向所述第三沉淀物中加入DNMT1單克隆抗體和PBS緩沖液進行渦旋反應1.5h～2h，經磁分離、棄上清處理后采用PBS緩沖液對其清洗2次，磁分離、棄上清得到第四沉淀物；