[發明專利]基于量子點熒光免疫檢測DNMT1的方法

有效

• 申請號: 201610324656.8
• 申請日: 2016-05-17
• 公開（公告）號: CN105842451B
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 吳擁軍;劉利娥;熊亞敏;玉崧成;于斐;何磊良;屈凌波;王華棟
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州德勤知識產權代理有限公司41128
• 代理人: 黃軍委,白毅明

1.一種基于量子點熒光免疫檢測DNMT1的方法，具體步驟包括：

按照下述步驟提供一種表面被DNMT1單克隆抗體共價修飾的Fe₃O₄納米免疫磁性顆粒，記為Fe₃O₄@McAb：

清洗：將Fe₃O₄納米顆粒懸浮液經超聲、磁分離棄上清處理后，采用濃度為0.01 mol/L～0.015 mol/L、pH為6.0的MES緩沖液對其平衡2min～5 min，然后進行磁分離、棄上清處理得到第一沉淀物；

活化：向所述第一沉淀物中依次加入濃度為8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液和濃度為8 mg/mL～11 mg/mL的NHS溶液進行渦旋反應10 min～15 min，經磁分離、棄上清處理后，采用MES緩沖液對其洗滌3～4次，然后再進行磁分離、棄上清處理得到第二沉淀物；

緩沖體系轉換：采用PBS緩沖液對所述第二沉淀物洗滌3～4次次，磁分離得到第三沉淀物；

偶聯：向所述第三沉淀物中加入DNMT1單克隆抗體和PBS緩沖液進行渦旋反應1.5 h～2 h，經磁分離、棄上清處理后采用PBS緩沖液對其清洗2次，磁分離、棄上清得到第四沉淀物；

封閉：向所述第四沉淀物中加入BSA封閉液，進行渦旋反應0.5 h～1 h，磁分離、棄上清處理后，采用PBST緩沖液清洗3～4次，磁分離、棄上清得到第四沉淀物即Fe₃O₄@McAb；

保存：在Fe₃O₄@McAb中加入PBS緩沖液，輕晃搖勻，4℃保存備用；

按照下述步驟提供一種表面被量子點標記的DNMT1多克隆抗體，記為QDs@PcAb：將pH為7.0～7.4的硼酸鹽緩沖液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入濃度為0.5 微摩爾每升～1 微摩爾每升的QDs和濃度為0.5 mg/mL～1 mg/mL的DNMT1多克隆抗體，每次加入上述物質后均需振蕩混勻；

然后向所述PE管中加入濃度為8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液，在18℃～25℃下渦旋反應1.5 h～2 h，反應結束后向所述PE管中加入含質量百分數為0.5%～1.0%的BSA封閉液的PBS緩沖液，在18℃～25℃下渦旋反應20 min～30 min；所得反應產物經離心、超濾除去EDC后溶于BS緩沖液中，4℃保存，從而制得QDs@PcAb；

將經CB緩沖液稀釋后的所述Fe₃O₄@McAb與經PBS緩沖液稀釋后的DNMT1標準樣或待測目標物進行溫育反應50 min～60 min，使得所述DNMT1標準樣或待測目標物被Fe₃O₄@McAb捕獲、富集分離；

然后將經PBST緩沖液稀釋后的所述QDs@PcAb與被Fe₃O₄@McAb捕獲、富集分離的所述DNMT1標準樣或待測目標物進行溫育反應110 min～130 min，使得所述QDs@PcAb與所述DNMT1標準樣或待測目標物相結合；經PBST緩沖液稀釋后，在多功能微孔板讀數儀上測定270 nm激發下反應產物的熒光強度；

根據檢測的熒光強度與所述DNMT1標準樣或待測目標物濃度之間的關系，分段建立檢測DNMT1的回歸方程；其中，在所述DNMT1標準品濃度為5.0 ng/mL～1500 ng/mL范圍內，所建立的回歸方程為Y=0.00775X+20.77161，其中，Y代表熒光值RFU，X為DNMT1標準品濃度，相關系數r為0.9873；在所述DNMT1標準品濃度為0.1 ng/mL～5.0 ng/mL范圍內，本方法檢測DNMT1的回歸方程為Y=0.02779X+1.29858，其中Y代表lgRFU，X代表lgDNMT1，相關系數r為0.9877。

2.根據權利要求1所述的基于量子點熒光免疫檢測DNMT1的方法，其特征在于，它還包括采用ELISA法檢測提供的所述Fe₃O₄@McAb的生物活性的步驟。