[發明專利]一種高效生產茯苓菌絲體和纖維素酶的培養基及培養方法

在審

• 申請號: 201610322671.9
• 申請日: 2016-05-17
• 公開（公告）號: CN105733969A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 李洪波;羅海艷;胡興
• 申請（專利權）人: 懷化學院
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/42;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種高效生產茯苓菌絲體和纖維素酶的液體培養基及其培養方法，具體來說，涉及一種以簡單無機鹽和富含纖維素廢棄物為培養基主要成分，無需搖床和恒溫培養，可以快速培養茯苓菌絲體并獲得含有高濃度纖維素酶的培養液，利用該方法，既有利于富含纖維素廢棄物的利用開發，又節約了能源和資源。

背景技術

茯苓，俗稱云苓、松苓、茯靈等，其原生物為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，多寄生于馬尾松或赤松的根部。茯苓是一種在中藥方劑里應用范圍最廣的真菌，藥理研究亦證實其茯苓萃取物具有消炎、免疫調節、止吐、抗氧化、抗腫瘤、鎮靜、利尿及降血糖等作用。茯苓是著名的家種大宗中藥材，現代醫學研究：茯苓能增強機體免疫功能，并有明顯的抗腫瘤及保肝臟作用。茯苓有效成分的研究中，研究得最多的就是茯苓多糖，即茯苓次聚糖，它具有抗腫瘤活性，其衍生物羧甲基茯苓糖已被證明具免疫促進及抗腫瘤作用，而U-茯苓多糖和羥乙基茯苓多糖則可抑制小鼠肉瘤細胞生長、調節免疫系統功能；其次是茯苓的三萜類化合物，可抑制癌細胞增生，目前的研究發現茯苓三萜類化合物還具有抗炎、抗腫瘤細胞生成及誘生集落刺激因子等作用。目前，茯苓種植需要大量的松樹和土地，而種植所得到的茯苓提取多糖和萜類需要經去除泥沙、皮和霉變部分，再經切塊粉碎后才能進行提取。從種植茯苓到前期加工，都需要大量的資源和能源消耗。不同產地生產的茯苓在品質上有很大差異，也影響到了茯苓產品的質量控制。因此，目前不少研究者以液體發酵發來培養得到茯苓菌體，但液體培養基組成中含有大量的酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖，為獲得大量茯苓菌絲體，往往采用補料發酵培養的方法，且需要控制溫度和供氧，耗電量高，因此并不經濟環保。

茯苓以松根為“食”，因此必然能分泌產生在量分解松材的酶類，如纖維素和木質素等。纖維素是大自然生物量最高的有機質，利用富含纖維素類物質為主要成分，在無需搖床或發酵罐，無需恒溫控制的情況下獲得大量茯苓菌絲體及發酵液，從中回收具有深入開發價值的茯苓菌絲體和廣泛應用價值的纖維素酶，不僅能大大減少對松林、能源的消耗及土地資源的占用，有利于節約能源和資源。因此，開發一種可以高效且廉價培養茯苓菌絲體的培養基及其培養方法，同時還可以獲得具有重要應用價值的纖維素酶，減少資源浪費并節約能源，有利于茯苓活性成分深加工產業的健康和可持續發展。

發明內容

基于此，本發明提供一種高效生產茯苓菌絲體和纖維素酶的液體培養基及其培養方法，利用本方法，可以實現利用廉價無機鹽培養基，在無需搖床或發酵罐的條件下，以富含纖維素的物質（以紙屑纖維為例進行說明）為唯一碳源，可以快速培養茯苓菌絲體并獲得含有高濃度纖維素酶的培養液。利用該方法，可以獲得大量的茯苓菌絲體和富含纖維素酶的培養液，節約了能源和資源，又有利于纖維類廢棄物的利用開發。

解決上述問題的技術方案如下：

一種高效生產茯苓菌絲體和纖維素酶的液體培養基及其培養方法主要包括以下步驟：

（1）無機鹽基礎培養基的配制：主要成分為（質量體積比）磷酸鉀(1-2%)和磷酸(0.2-1%)；

（2）微量元素及生長因子溶液的配制：主要成分為：Fe²+(1-2mol/L)Cu²⁺(10-40mmol/L)、Zn²⁺(2-20mmol/L)、Mo²⁺(50-200mmol/L)、Mn²⁺(20-50mmol/L)、Bo₃^-(2-40μmol/L)、I^-(1-10μmol/L)、生物素（40mg/L）、復合維素B(10mg/L)；

（3）茯苓菌絲的活化：取無機鹽基礎培養基用氨水調節pH5-6和1%（質量體積比）葡萄糖，于廣口三角瓶內封口膜密封（培養液體積不超過三角瓶體積的1/10），121℃濕熱滅菌15分鐘后冷卻至室溫，無菌工作臺內添加0.1%微量元素及生長因子溶液，將市售茯苓菌種試管斜面生長的茯苓菌絲劃成0.5-1平方厘米的菌絲塊，接種5-10塊菌絲，室溫下培養至菌絲體長滿三角瓶瓶底；

（4）茯苓菌絲體的擴大培養：取無機鹽基礎培養基用氨水調節pH5-6，加入1-5%（質量體積比）經粉碎的富含纖維素的物質（以紙屑纖維為例進行說明），按不超過培養瓶體積10%的量加入到培養瓶中，121℃濕熱滅菌15分鐘后冷卻至室溫，按1：50左右比例將三角瓶中的活化菌絲體轉接到培養瓶中，室溫下培養2周左右菌絲體可長滿三角瓶瓶底液面；