[發明專利]一種低血清培養豬肺炎支原體培養基及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610320680.4
• 申請日: 2016-05-16
• 公開（公告）號: CN105779362A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 朱燕鋒;羅意;盧業云;許俊才
• 申請（專利權）人: 南京大爻網絡科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

技術領域

本發明涉及獸用生物制品技術領域，涉及一種低血清培養豬肺炎支原體培養基及其制備方法和應用。

背景技術

豬支原體肺炎又稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病，廣泛存在于世界各地。豬只感染后除導致飼料轉化率降低、生長發育不良外，且易繼發病毒或細菌感染，造成豬死亡率升高，導致經濟損失慘重。疫苗免疫是預防本病最重要的手段。

目前，培養豬肺炎支原體活疫苗的培養基主要有1975年Goodwin等發明的Friis培養基，2006年農業行業標準中提出的A₂₆培養基，以及江蘇省農科院發明的KM₂培養基等。

南京天邦生物科技有限公司，于2012年發明的一種低血清高效培養豬肺炎支原體培養基及其制備方法，初步解決了培養基及其培養工藝在培養豬肺炎支原體168株存在的所用動物血清過多易引起過敏反應，降低血清中外源病毒或其他微生物會加大豬肺炎支原體活疫苗培養的風險。

在以上所有培養基及培養方式上，仍然需要進一步降低血清的使用劑量，甚至無血清培養基的高效培養方式，才能達到目前的培養需求。

發明內容

解決的技術問題：本發明提供一種低血清培養豬肺炎支原體培養基及其制備方法和應用，能夠降低培養豬肺炎支原體所需的血清用量，達到傳統培養基的培養效果。

技術方案：一種低血清培養豬肺炎支原體培養基，由基礎培養基和輔助培養基組成，其中基礎培養基包括MEM3-4g、酵母粉1-2g、葡萄糖3-4g、蛋白胨6-8g、0.5wt.%酚紅溶液1-2mL、氯化鈉1-2g、Na₂HPO₄·12H₂O0.5-1.0g、KH₂PO₄0.1-0.2g、去離子水400-600mL；輔助培養基包括酵母浸出汁30-60mL，20wt.%L-精氨酸溶液0.5-1mL，3wt.%谷氨酰胺溶液40-50mL，青霉素終濃度為100-300U/mL，滅活的豬血清40-100mL；所述基礎培養基還含有氯化鉀0.1-0.5g；所述輔助培養基還含有0.01g/mL膽固醇甘油溶液5-10mL、10wt.%甘氨酸溶液0.5-1mL，10wt.%L-半胱氨酸溶液1-2mL；最后，將配置好的基礎培養基和輔助培養基混合，并用1mol/L氫氧化鈉溶液調整pH值至7.4-7.6。

上述方案中，以整體計每400mL培養基中加滅活的豬血清不高于40mL，即整體培養基中血清添加的體積比例小于10%。

上述0.01g/mL膽固醇甘油溶液的制備方法為：用0.1-0.5g膽固醇溶于10-50mL甘油內，并在116℃滅菌30min，冷卻至37℃。

低血清培養豬肺炎支原體培養基的制備方法，按照下列步驟進行：a、制備基礎培養基：將基礎培養基的所有成分，攪拌均勻混合，全部溶解，在116℃滅菌30min，待冷卻后備用；b、制備輔助培養基：將輔助培養基的成分過濾除菌，混合攪拌，既得輔助培養基；c、將高壓冷卻滅菌好的基礎培養基和輔助培養基混合，用過濾除菌的1mol/LNaOH調節pH值7.4-7.6，分裝備用。

上述培養基在培養豬肺炎支原體中的應用。

有益效果：1、本發明制備的豬肺炎支原體培養基，在培養肺炎支原體時可以降低培養基中血清的使用量，達到傳統培養基的培養效果，并能減少動物應激反應。

2、本發明制備的豬肺炎支原體培養基，用CCU方法測定該培養基制備的菌液效價達到10^8-9/mL，在培養基原料種類及成本上明顯優于KM₂培養基，達到培養豬支原體肺炎弱毒活疫苗（168株）的生產要求。

具體實施方式

下面的實施例可使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。在不背離發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1

1、制備基礎培養基：