[發明專利]一種利用LAMP技術檢測植物組織中茄科青枯菌的方法

有效

• 申請號: 201610312802.5
• 申請日: 2016-05-11
• 公開（公告）號: CN105779631B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 佘小漫;何自福;湯亞飛;藍國兵
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 蘇運貞,裘暉

1.一種利用LAMP技術檢測植物組織中茄科青枯菌的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)環介導等溫擴增茄科青枯菌引物設計：選取茄科青枯菌的特異基因hrpB，設計適合環介導等溫擴增的引物FIP、F3、BIP、B3和環引物LoopF；

FIP：5’-CGCGTAGTCGTCGGACTTTCC-CCGTGCGTATCAGCTCGT-3’；

F3：5’-TTTCGCCGCTGATTTCGA-3’；

BIP：5’-AGTGCGATGAAGAAGCGGAAGA-CAGCTGGTCATCCGAATGG-3’；

B3：5’-CTGCCAGCCGGTATTGC-3’；

LoopF：5’-TCGCTGGGAGGAGTGGT-3’；

(2)檢測病樣品的準備：取待檢病樣的莖基部和根部，用水沖洗干凈，取含有維管束的病組織；

(3)青枯菌懸浮液制備：用滅菌的鑷子將步驟(2)中獲取的病組織放入滅菌容器中，加入滅菌水，靜置，得到待檢病樣品懸浮液；

(4)環介導等溫擴增法反應：以步驟(3)獲得的待檢病樣品懸浮液為模板，用步驟(1)的引物進行LAMP反應；

(5)鑒別結果：通過肉眼觀察環介導等溫擴增的反應產物，如反應產物為綠色的渾濁液體，即確認病樣中含有茄科青枯菌；如反應產物為橙色透明液體，則表明病樣不含有茄科青枯菌；

步驟(4)中所述的LAMP反應的反應條件為62℃恒溫1h，95℃恒溫2min。

2.根據權利要求1所述利用LAMP技術檢測植物組織中茄科青枯菌的方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的病組織的大小為2～3mm×3～4mm；

步驟(3)中所述的滅菌水的用量為大小為2～3mm×3～4mm的病組織配比500μL滅菌水。

3.根據權利要求1所述利用LAMP技術檢測植物組織中茄科青枯菌的方法，其特征在于：所述的靜置的時間為10～20分鐘。

4.根據權利要求3所述利用LAMP技術檢測植物組織中茄科青枯菌的方法，其特征在于：所述的靜置的時間為15分鐘。

5.根據權利要求1所述利用LAMP技術檢測植物組織中茄科青枯菌的方法，其特征在于：

步驟(4)中所述的LAMP反應的反應體系如下：每25μL反應體積中，含1μL待檢病樣品懸浮液、12.5μL 2×反應緩沖液、濃度為50μM的引物FIP和BIP各2μL、濃度為50μM的引物LoopF 1μL、濃度為50μM的引物F3和B3各0.5μL、Bst DN聚合酶1μL、熒光目測反應液1μL，去離子水補足至25μL；

所述的2×反應緩沖液的組成如下：40mM、pH8.8的Tris-HCl，濃度為20mM的KCl、濃度為16mM的MgSO₄、濃度為20mM的(NH₄)₂SO₄、濃度為體積百分比0.2％的Tween-20、濃度為1.6M的甜菜堿、濃度為2.8mM的dNTPs。

6.根據權利要求1所述利用LAMP技術檢測植物組織中茄科青枯菌的方法，其特征在于：所述的植物為茄子、番茄、煙草、馬鈴薯、辣椒、花生、沙姜、生姜和甘薯中的一種以上。