[發(fā)明專利]一種利用LAMP技術(shù)檢測(cè)植物組織中茄科青枯菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610312802.5
• 申請(qǐng)日: 2016-05-11
• 公開（公告）號(hào): CN105779631B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 佘小漫;何自福;湯亞飛;藍(lán)國(guó)兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司44245
• 代理人: 蘇運(yùn)貞,裘暉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用LAMP技術(shù)檢測(cè)植物組織中茄科青枯菌的方法。

背景技術(shù)

對(duì)于茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的青枯病檢測(cè)鑒定方法，主要有傳統(tǒng)的植物病原細(xì)菌分離與鑒定方法、BIOLOG GEⅢMicroStation微生物鑒定系統(tǒng)、PCR鑒定方法及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)。

傳統(tǒng)的植物病原細(xì)菌分離與鑒定方法，主要包括從病樣中分離病原菌、獲得分離菌株的純培養(yǎng)、菌落與菌體形態(tài)特征觀察、生理生化特性測(cè)定和致病性測(cè)定等步驟，該鑒定過(guò)程至少需要1個(gè)月以上，工作量大，且需要專業(yè)技術(shù)人員操作。

BIOLOG GEⅢ MicroStation微生物鑒定系統(tǒng)，利用微生物對(duì)不同碳源呼吸代謝的差異，通過(guò)檢測(cè)呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化還原物質(zhì)與顯示物質(zhì)(如TTC、TV)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化(吸光度)以及微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異(濁度)，生成特征指紋圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，即可得出最終鑒定結(jié)果。該系統(tǒng)的鑒定過(guò)程需要5-7天，且需要購(gòu)買昂貴的儀器設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

PCR鑒定方法，主要包括根據(jù)已知茄科青枯菌保守序列設(shè)計(jì)PCR引物、在PCR管中加入反應(yīng)成分、PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)等步驟。該方法較特異、快速、靈敏，成本也較低，但需要購(gòu)買PCR儀。目前利用PCR檢測(cè)茄科青枯菌需要2.5h左右。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種利用LAMP技術(shù)檢測(cè)植物組織中茄科青枯菌的方法。該方法以茄科青枯菌特有基因hrpB序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)與鑒定植物組織中茄科青枯菌的體系，結(jié)果可靠，可應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種利用LAMP技術(shù)檢測(cè)植物組織中茄科青枯菌的方法，包括如下步驟：

(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增茄科青枯菌引物設(shè)計(jì)：選取茄科青枯菌的特異基因hrpB，設(shè)計(jì)適合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物FIP、F3、BIP、B3和環(huán)引物L(fēng)oopF；

FIP：5’-CGCGTAGTCGTCGGACTTTCC-CCGTGCGTATCAGCTCGT-3’；

F3：5’-TTTCGCCGCTGATTTCGA-3’；

BIP：5’-AGTGCGATGAAGAAGCGGAAGA-CAGCTGGTCATCCGAATGG-3’；

B3：5’-CTGCCAGCCGGTATTGC-3’；

LoopF：5’-TCGCTGGGAGGAGTGGT-3’；

(2)檢測(cè)病樣品的準(zhǔn)備：取待檢病樣的莖基部和根部，用水沖洗干凈，取含有維管束的病組織；

(3)青枯菌懸浮液制備：用滅菌的鑷子將步驟(2)中獲取的病組織放入滅菌容器中，加入滅菌水，靜置，得到待檢病樣品懸浮液；

(4)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法反應(yīng)：以步驟(3)獲得的待檢病樣品懸浮液為模板，用步驟(1)的引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)；

(5)鑒別結(jié)果：通過(guò)肉眼觀察環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物，如反應(yīng)產(chǎn)物為綠色的渾濁液體，即確認(rèn)病樣中含有茄科青枯菌；如反應(yīng)產(chǎn)物為橙色透明液體，則表明病樣不含有茄科青枯菌。

步驟(2)中所述的病組織的大小優(yōu)選為2～3mm×3～4mm。

步驟(3)中所述的容器優(yōu)選為離心管。

步驟(3)中所述的滅菌水的用量?jī)?yōu)選為大小為2～3mm×3～4mm的病組織配比500μL滅菌水。

步驟(3)中所述的靜置的時(shí)間優(yōu)選為10～20分鐘；更優(yōu)選為15分鐘。

步驟(4)中所述的LAMP反應(yīng)的反應(yīng)體系優(yōu)選如下：每25μL反應(yīng)體積中，含1μL待檢病樣品懸浮液、12.5μL 2×反應(yīng)緩沖液、濃度為50μM的引物FIP和BIP各2μL、濃度為50μM的引物L(fēng)oopF 1μL、濃度為50μM的引物F3和B3各0.5μL、Bst DN聚合酶1μL、熒光目測(cè)反應(yīng)液1μL，去離子水補(bǔ)足至25μL。

所述的2×反應(yīng)緩沖液的組成如下：40mM、pH8.8的Tris-HCl，濃度為20mM的KCl、濃度為16mM的MgSO₄、濃度為20mM的(NH₄)₂SO₄、濃度為體積百分比0.2％的Tween-20、濃度為1.6M的甜菜堿(Betaine)、濃度為2.8mM的dNTPs。