[發明專利]一種東方蜜蜂微孢子蟲的LAMP檢測引物及其檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610312738.0
• 申請日: 2016-05-12
• 公開（公告）號: CN105755158A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 梁勤;席偉軍;李江紅;陳大福;郭睿
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于生物技術領域。更具體地，涉及一種東方蜜蜂微孢子蟲的LAMP檢測引物及其檢測試劑盒。

背景技術

東方蜜蜂微孢子蟲是一種重要的蜜蜂真菌病原，廣泛寄生于蜜蜂中腸組織，導致蜜蜂，尤其是西方蜜蜂罹患微孢子蟲病，不僅縮短成年蜂個體壽命而且減弱蜂群群勢，也影響蜂產品產量。與此同時，目前仍無一種有效防治蜜蜂微孢子蟲病的藥物。

在科學研究和養蜂生產中，通過蜜蜂感染微孢子蟲后的行為和中腸組織形態變化與顯微鏡檢的方法進行診斷，結果均相對滯后且不可靠、檢測率低以及難以區別兩種孢子（如鏡檢時可能與中腸中酵母細胞相混淆），電鏡鑒定方法需要較高的專門操作技術和精密儀器，PCR檢測需要較昂貴的儀器且檢測時間較長，而LAMP檢測成本低廉且無需復雜儀器。目前用PCR檢測于兩種蜜蜂微孢子蟲病病原多是針對和16SrRNA（SSU）區序列（HigesM,MartinR,MeanaA.Nosemaceranae,anewmicrosporidianparasiteinhoneybeesinEurope.J.Inver.Pat.,2006,92(2):93-95；Chen,Yanping，Evans,JayD.，Smith,I.Bart，Pettis,JefferyS.Nosemaceranaeisalong-presentandwide-spreadmicrosporidianinfectionoftheEuropeanhoneybee(Apismellifera)intheUnitedStates.J.Inver.Pat.,2008,97(2):186-188.)，但Gisder等（GisderS,GenerschE.MoleculardifferentionofNosemaapisandNosemaceranaebasedonspecies-specificsequencedifferencesinaproteincodinggene.J.Inver.Pat.,2013,113(1):1-6.）報道了以16SrRNA為擴增序列檢測兩種蜜蜂微孢子蟲病混合樣時結果的不可靠性和低陽性率，及Erler等（ErlerS,LommatzschS,LattorffHM.Comparativeanalysisofdetectionlimitsandspecificityofmoleculardiagnosticmarkersforthreepathogens(Microsporidia,Nosemaspp.)inthekeypollinatorsApismelliferaandBombusterrestris.ParasitolRes,2012,110(4):1403-1410.）研究了前人報道的以ITS、SSU或16SrRNA為擴增區檢測微孢子（Nosemaspp.）的PCR引物的特異性和靈敏性，部分引物在Nosemabombi、N.apis和N.ceranae三者間特異性存在交叉。RPB1基因（東方蜜蜂微孢子蟲：Genbank登錄號：XM_002995356.1）為靶序列設計的PCR引物檢測東方蜜蜂微孢子蟲并無非特異性條帶及假陽性結果，也達到了很好的檢測靈敏度。但是使用該基因設計的PCR引物對于東方蜜蜂微孢子蟲檢測操作步驟較多，且花費時間較長，不適于基層單位檢測，也不利于生產上的廣泛推廣和使用。