[發明專利]一種將單磺酸四氮唑鹽用于檢測細胞活力的用途及方法

在審

• 申請號: 201610310459.0
• 申請日: 2016-05-11
• 公開（公告）號: CN107365827A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 阮奔放;阮健昵福
• 申請（專利權）人: 杭州健昵福生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/02
• 代理公司: 浙江英普律師事務所33238
• 代理人: 陳小良,王炎軍

技術領域

本發明涉及醫學生物檢測技術領域，尤其涉及將單磺酸四氮唑鹽用于檢測細胞活力的用途及方法。

背景技術

NAD(P)⁺/NAD(P)H是一類重要的輔酶因子，存在于所有生物體中，包括細菌、放線菌、藍藻、酵母菌、霉菌、真菌，一般動植物，其作為反應介質參與多種生命過程，包括能量代謝，線粒體功能，鈣穩態，氧化應激，基因調節，免疫功能，老化和細胞死亡等。因此，一種基于細胞水平、靈敏低毒的檢測方法來測定NAD(P)H或與其相關酶反應的變化，在科研、環境保持、醫療診斷等應用中具有關鍵的作用。

已報道有多種不同類型的四氮唑鹽可測定細胞活力，例如TTC、MTT、WST-8。TTC(2,3,5-三苯基四氮唑)為脂溶性光敏感復合物，劇毒，高溫會被嚴重破壞。MTT(3(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2 5-苯基-2-四氮唑)是一種接受氫離子的染料，它與TTC在檢測細胞活性試驗中生成的甲臜水溶性極差，需加有機試劑(如DMSO)進行溶解，易發生溶解不完全進而影響實驗準確性，且吸取上清液操作時易帶走部分細胞。另一方面，MTT除被線粒體脫氫酶類還原外，還可被多種其他物質還原，如血清白蛋白，L-抗壞血酸，β-巰基乙醇，谷胱甘肽s-轉移酶等，而目前市面上最常用的試劑CCK8(WST-8)經實驗證實也會被β-巰基乙醇、EGCG等抗氧化劑還原，導致檢測細胞活力試驗中出現假陽性。

專利CN201510757078.2-一類具有單磺酸苯基四氮唑結構的化合物及其應用提供了單磺酸四氮唑化合物的合成方法，簡言之，在65℃下將4-硝基苯肼(0.958g)溶解于甲醇(22ml)中，在50℃下用2-甲酰基苯磺酸鈉(1.188g)處理2小時。經處理后，得到橙紅色固體肼，產率87％。在第二步中，將所得的肼(0.614g)溶于20ml甲醇中，與新鮮制備的2-甲氧基-4-硝基苯重氮鹽(0.36g)和1mol/L氫氧化鈉(0.9ml)在0℃下反應2小時，然后升溫至25℃反應2hrs。后處理后，得到甲臜，產率85％。在第三步中，在0℃將甲臜(0.522g)溶于甲醇(18ml)，加入37％的HCl(2g)，用過氧化氫(2.27ml，20mM)氧化2hrs，然后在25℃過夜反應。后處理和硅膠柱純化后，得到了四氮唑鹽EZMTT，產率99％，純度45％。

發明內容

單磺酸四氮唑鹽作為一種新型的單磺酸四氮唑化合物，實驗原理與WST-8類似：在電子耦合試劑1-methoxy PMS存在的情況下，可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產物(formazan)，通過酶標儀測定450nm波長OD值。活細胞數量越多，則吸光度越高。單磺酸四氮唑鹽相應的甲臜產物高度水溶、細胞毒性低、靈敏度高、具有抗氧化性藥物篩選不產生假陽性，因此在藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等應用上具有廣闊的前景。

利用新型單磺酸四氮唑鹽試劑的顏色變化實時監測細胞活力，提供了一種細胞活力的檢測方法。測試劑選用單磺酸四氮唑鹽檢測體系，在NAD(P)H水平及活細胞數量上呈現良好的線性劑量關系；測試劑通過單磺酸四氮唑鹽反應物在450nm的吸光度值，得到EC₅₀曲線，進行細胞活力評價。

本發明的檢測方法是一種基于細胞高度靈敏的檢測方法。本發明方法中提供的單磺酸四氮唑鹽細胞毒性小，適用于活細胞基礎試驗；單磺酸四氮唑鹽試劑溫和且檢測后的細胞可經漂洗進一步用于后續實驗；單磺酸四氮唑鹽試劑不易與還原性物質反應，干擾小；該試劑適用范圍廣，包括環境微生物富集后的檢測，藻類、真菌及動植物細胞活力的檢測，細胞及組織病變的檢測。

本發明針對現有技術的缺點，提供了一種細胞活力檢測方法；包括如下內容：

一種將單磺酸四氮唑鹽用于檢測細胞活力的用途，其特征在于：所述的單磺酸四氮唑鹽化學式為：

一種細胞活力的檢測方法，所述的檢測方法包括如下步驟：

步驟一、在培育好的含待測細胞的培養基中加入單磺酸四氮唑鹽檢測試劑，培育1小時以上；

步驟二、在450±20nm處測定其吸光度，得到標準曲線；通過觀察待測細胞的劑量響應對細胞活力進行評價。

所述的單磺酸四氮唑鹽檢測試劑包括單磺酸四氮唑鹽或含有培養基的單磺酸四氮唑鹽與1-methoxy PMS。

優選地，所述的一種細胞活力的檢測方法中的單磺酸四氮唑鹽的濃度為0.1～10mM，1-methoxy PMS的濃度為5～25μM。