[發(fā)明專利]一種利用畢赤酵母高效分泌表達(dá)轉(zhuǎn)肽酶Sortase A的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610308645.0
• 申請(qǐng)日: 2016-05-11
• 公開（公告）號(hào): CN105754885B
• 公開（公告）日: 2020-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳志猛;趙鑫銳;洪皓飛;鄧濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N9/52;C12R1/84
• 代理公司: 23211 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 耿曉岳

本發(fā)明公開了一種利用畢赤酵母高效分泌表達(dá)轉(zhuǎn)肽酶Sortase A的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明成功實(shí)現(xiàn)了Sortase A在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)，解決了目前已有報(bào)道中該酶在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)中存在的產(chǎn)率較低、菌體需要破壁和菌株不穩(wěn)定的問題。經(jīng)過表達(dá)策略的篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化，胞外Sortase A的酶活和濃度分別可達(dá)131.9U/mL和97.8mg/L。本發(fā)明通過實(shí)現(xiàn)Sortase A的高效分泌表達(dá)，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用畢赤酵母高效分泌表達(dá)轉(zhuǎn)肽酶Sortase A的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

Sortase A是一類介導(dǎo)革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁錨定蛋白與細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合的轉(zhuǎn)肽酶，近些年其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用吸引了越來越多的關(guān)注。自從2004年首次報(bào)道應(yīng)用Sortase A作為一種蛋白質(zhì)或多肽的連接工具以來，Sortase A參與的連接反應(yīng)迅速成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物醫(yī)藥以及生物工程技術(shù)等領(lǐng)域。但到目前為止，關(guān)于Sortase A高效表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)的研究卻很少，酶的表達(dá)方式仍主要局限于大腸桿菌的胞內(nèi)表達(dá)。Sortase A的胞內(nèi)表達(dá)存在以下幾個(gè)主要的缺陷：(1)產(chǎn)率較低：在已有的報(bào)道中，最高產(chǎn)率僅為76.9mg/L；(2)胞內(nèi)表達(dá)的Sortase A易在菌體內(nèi)形成包涵體，且純化前還需要經(jīng)過耗時(shí)且成本較高的細(xì)胞破碎步驟；(3)Sortase A的表達(dá)載體是游離型的質(zhì)粒，易于丟失，會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性不穩(wěn)定容易退化。因此，急需實(shí)現(xiàn)Sortase A的高效分泌表達(dá)，以滿足未來在蛋白質(zhì)工程、酶工程中對(duì)Sortase A日益增長(zhǎng)的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題首先是提供一種高效分泌表達(dá)轉(zhuǎn)肽酶Sortase A的重組畢赤酵母，用于實(shí)現(xiàn)Sortase A的高效分泌表達(dá)。

所述重組畢赤酵母是以pPIC9k(含α信號(hào)肽)為表達(dá)載體，選擇AOX1或GAP啟動(dòng)子，以畢赤酵母GS115、SMD1168或KM71為表達(dá)宿主，構(gòu)建得到分泌表達(dá)Sortase A的基因工程菌株。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以AOX1為啟動(dòng)子。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以畢赤酵母SMD1168為宿主。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以AOX1為啟動(dòng)子、SMD1168為宿主，構(gòu)建得到一株重組畢赤酵母。

本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用重組畢赤酵母生產(chǎn)轉(zhuǎn)肽酶Sortase A的方法，是將重組畢赤酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)使其表達(dá)轉(zhuǎn)肽酶Sortase A。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，重組畢赤酵母在BMGY培養(yǎng)基中活化。所述BMGY培養(yǎng)基含13.4g/L不含氨基酸的YNB，20g/L蛋白胨，10g/L酵母膏，10g/L甘油，100mM磷酸鹽。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，活化后的重組畢赤酵母轉(zhuǎn)接至初始pH6.0的BSM無機(jī)培養(yǎng)基中，28℃誘導(dǎo)產(chǎn)酶，每隔24h加入1.5％含微量元素的純甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)72h。所述BSM無機(jī)培養(yǎng)基含26.7ml/L磷酸，0.93g/L硫酸鈣，18.2g/L硫酸鉀，14.9g/L硫酸鎂，4.13g/L氫氧化鉀，40g/L甘油。所述含微量元素的純甲醇是含CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，KI0.088g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂·6H₂O 0.5g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 65.0g/L，Biotin 0.2g/L，濃H₂SO₄5.0mL/L的純甲醇。