[發明專利]重組阿達木單抗Fab片段在昆蟲細胞表達系統中的制備方法

在審

• 申請號: 201610307094.6
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN107354171A
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 呂立力;劉翯;汪俊;陳春麟
• 申請（專利權）人: 美迪西普亞醫藥科技（上海）有限公司;上海美迪西生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C07K16/24
• 代理公司: 上海瀚橋專利代理事務所(普通合伙)31261
• 代理人: 曹芳玲,鄭優麗

技術領域

本發明涉及全人源adalimumab Fab片段在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統中的制備方法，屬于生物技術領域。

背景技術

Adalimumab即阿達木單抗，商品名Humira(修美樂)是近年來全球最暢銷的生物藥，是首個獲FDA批準的全人源單克隆抗體藥物。Adalimumab由雅培制藥公司開發(US6090382)，現屬于艾伯維公司，是IgG分子的抗原結合片段(antigen-binding fragments,Fab片段)。Adalimumab Fab片段是人單克隆D2E7重鏈和輕鏈經二硫鍵結合的二聚物，能特異性地與TNF-α結合從而阻斷其與p55、p75細胞表面的TNF-α受體的相互作用，用于治療類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)，銀屑病關節炎(psoriatic arthritis,PA)，強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)，和克羅恩病(Crohn's disease,CD)等疾病，并能緩解抗風濕性藥物(DMARD)治療無效的中至重度RA患者的體征和癥狀。

Fab是IgG分子的抗原結合片段，是由Fd片段與輕鏈通過二硫鍵結合形成的異二聚合體，因其相對分子質量小、有高度確定的完整性結構和免疫原性低等優點成為IgG類抗體生產和改造的首選。由于Fab片段沒有Fc段，不需要進行復雜的糖基化和翻譯后修飾，所以不需要通過哺乳動物細胞系統來生產。而Bac-to-Bac昆蟲細胞表達系統與其他真核表達系統相比有許多優勢：能高水平表達外源基因；大多數表達的重組蛋白可溶；能進行翻譯后的加工修飾：包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號肽切除等；較容易分離純化；昆蟲細胞懸浮生長易放大培養，有利于大規模表達重組蛋白。

發明內容

本發明的目的在于提供一種在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統中分泌共表達獲得重組adalimumab Fab片段的制備方法。本發明人經研究發現，通過利用昆蟲細胞作為宿主進行表達，可獲得具有生物活性的重組adalimumab Fab蛋白。

在此，本發明提供一種全人源單克隆抗體adalimumab Fab片段的制備方法，包括：

(a)將N端分別帶有信號肽的Fab片段的重鏈(heavy chain，Hc)與輕鏈(light chain，Lc)的氨基酸序列的基因克隆于帶有雙啟動子的桿狀病毒表達載體(優選為pFastBacT1)內構建重組表達載體；

(b)將所得的重組表達載體轉座至感受態細胞中，篩選重組菌斑，提取重組質粒，并將其轉染至昆蟲細胞中，得到重組桿狀病毒后進一步擴增病毒，并使用病毒感染放大培養的昆蟲 細胞以表達Fab蛋白，離心收集含Fab蛋白的上清產物；

(c)將所得昆蟲細胞表達上清首先使用膜包進行超濾濃縮和置換緩沖溶液，然后色譜柱純化，即可得到全人源單克隆抗體adalimumab Fab片段。

本發明運用基因工程等技術手段，將帶有信號肽(例如Ac NPV gp64)的Fab片段的重鏈與輕鏈分別克隆至桿狀病毒載體(例如pFastBacT1)中，獲得重組質粒，將重組質粒轉座到感受態細胞(例如DH10Bac)中獲得重組Bacmid DNA，轉染昆蟲細胞(例如Sf9)獲得重組桿狀病毒，利用病毒感染昆蟲細胞，分泌共表達目的蛋白，離心收集含目的蛋白的上清產物。再進行色譜柱純化，得到有生物活性的adalimumab Fab蛋白。經本發明方法獲得的全人源單克隆抗體adalimumab Fab片段經分析顯示純度較高，且能特異性結合TNF-α，其抑制效果與標準品Humira相似，說明本發明方法Fab片段保留了標準品Humira具備的抗原結合性和特異性；而該Fab片段分子量低易靶向作用于病灶，另外昆蟲細胞懸浮生長易放大培養，該Fab片段可以在昆蟲細胞中大規模表達生產，易于分離純化。

本發明中，選用昆蟲細胞桿狀病毒表達載體pFastBacT1共分泌表達，能容納大分子的插入片段，表達多種外源基因并可以高效并大量表達外源基因。通過添加外分泌信號肽可以分泌共表達Fab蛋白于昆蟲細胞上清中，利用胞外的氧化環境，能夠指導Fab重鏈和輕鏈間二硫鍵的形成。

較佳地，在步驟(a)中，所述重組表達載體為pFastBacT1，包括：兩個啟動子、復制子、多克隆酶切位點、和兩個終止子。

較佳地，在步驟(a)中，Fab片段的Lc與Hc的N端的信號肽為外分泌信號肽AcNPV gp64。較佳地，Fab片段的重鏈和輕鏈的啟動子皆為多角體基因啟動子(polyhedrin(PH)promoter)。