[發明專利]重組阿達木單抗Fab片段在昆蟲細胞表達系統中的制備方法

在審

• 申請號: 201610307094.6
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN107354171A
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 呂立力;劉翯;汪俊;陳春麟
• 申請（專利權）人: 美迪西普亞醫藥科技（上海）有限公司;上海美迪西生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C07K16/24
• 代理公司: 上海瀚橋專利代理事務所(普通合伙)31261
• 代理人: 曹芳玲,鄭優麗

1.一種使用昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統制備重組阿達木單抗Fab片段的方法，其特征在于，包括：

（a）將N端分別帶有信號肽的Fab片段的輕鏈與重鏈的氨基酸序列的基因克隆于帶有雙啟動子的桿狀病毒表達載體內構建重組表達載體；

（b）將所得的重組表達載體轉座至感受態細胞中，篩選重組菌斑，提取重組質粒，并將其轉染至昆蟲細胞中，得到重組桿狀病毒后進一步擴增病毒，并使用病毒感染放大培養的昆蟲細胞以表達Fab蛋白，離心收集含Fab蛋白的上清產物；

（c）將所得昆蟲細胞表達上清首先使用膜包進行超濾濃縮和置換緩沖溶液，然后色譜柱純化，即可得到全人源單克隆抗體阿達木單抗Fab片段。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟（a）中，Fab片段的重鏈和輕鏈的N端的信號肽皆為外分泌信號肽Ac NPV gp64。

3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，在步驟（a）中，Fab片段的重鏈和輕鏈的啟動子皆為多角體基因啟動子。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟（a）中，所述重組表達載體為pFastBacT1，包括：兩個啟動子、復制子、多克隆酶切位點、和兩個終止子。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟（b）中，所述感受態為DH10Bac，轉座菌斑篩選方法為藍白斑篩選法。

6.根據權利要求1至5中任一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟（b）中，所述昆蟲細胞為Sf9細胞。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的制備方法，其特征在于，轉染試劑為脂質體cellfection，轉染步驟中所用培養基為Sf-900^TM II SFM培養基。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟（b）中，所述重組桿狀病毒P0擴增病毒P1，即將200μL重組桿狀病毒P0加入100 mL細胞密度為2×10⁶ cells/ml 的Sf9昆蟲細胞中，37 ℃搖床培養96 h后離心獲得病毒P1。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟（b）中，放大培養細胞并表達所用的培養基為ESF AF培養基。

10.根據權利要求1至9中任一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟（c）中，所述純化包括：膜包進行超濾濃縮和置換緩沖溶液；以及親和層析和分子篩介質層析；其中所述親和柱層析的親和介質為Protein L；所述分子篩介質層析的分子篩層析介質為Superdex^TM 75。