[發明專利]一種植物細胞規模培養方法

在審

• 申請號: 201610305789.0
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN107354123A
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 張杰
• 申請（專利權）人: 張杰
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N5/02
• 代理公司: 南京艾普利德知識產權代理事務所(特殊普通合伙)32297
• 代理人: 陸明耀

技術領域

本發明屬于植物組織工程技術領域。本發明涉及一種植物生物技術克隆工程，特別是針對銀杏、紅豆杉、鐵皮石斛、丹參等藥用價值很高卻生長緩慢、產量極低、對環境條件要求十分苛刻的瀕危物種，以及具有某些藥用成分的蔬菜瓜果，例如西瓜，苦瓜等，或者對土地破壞比較嚴重，例如甘草等植物。

背景技術

隨著城市化進程的迅速發展和人口的不斷增長，生態環境的不斷退化，使許多名貴中藥材資源枯竭和瀕滅。特別是針對像銀杏、紅豆杉、鐵皮石斛這種藥用價值很高卻生長緩慢、產量極低、對環境條件要求十分苛刻的瀕危物種，其社會效益很大。另一方面，由污染導致的食品安全問題已非常嚴重，農藥殘留和重金屬超標是中草藥植物的一大問題，也亟需解決。

隨著現代科技進步，植物組織工程方法的優勢越來越明顯，首先，這種方法不占用土地，節約了耕地資源；其次，不受天氣狀況影響，產量穩定；第三，無農殘重金屬殘留；第四，可通過人為調整改變目標物質的含量。因此，在污染日益嚴重，土地資源匱乏的現代社會，通過植物組織工程的高科技手段生產出有效成分含量穩定、過程可控、不消耗過多土地資源的植物原料是大勢所趨。

本發明根據高等植物細胞的兩個全能性：植物細胞具有分化成完整植株的全能性和植物細胞能合成原生植株藥用有效成份的全能性。針對銀杏、紅豆杉、鐵皮石斛、丹參、西瓜、苦瓜等具體物種，發明了一整套從原生植株成株莖段休眠芽上直接誘導出愈傷組織，直接用愈傷組織或用誘導出的植物愈傷組織進行單細胞懸液制備，再利用組織工程技術對該細胞進行懸浮式的工業化大規模擴增，進而將該方法與人工光源相結合，利用控制溫度、酸堿度、氧含量、以及生長調節劑比例等將生產規模擴大到噸級以上的規模。

利用本發明的植物懸浮細胞規模培養工藝，其生長速率達到9-50毫克/克·天；相當于自然生長速度的數百甚至數千倍。利用規模化培養基礎罐(50升)每7-50天產量可達2-20公斤干品，擴增產能每罐得率均在2.5-25％以上，得干率lO％以上。通過實施本發明的技術工藝，使中藥材及某些有療效的蔬菜水果的生物培養規模從土地種植的低水平向工廠化生產規模轉化。同時，由于生產流程得到了良好的控制，使農殘重金屬幾乎檢測不到，大大提高了產品長期服用的安全性。

發明內容

本發明為一種體外規模化懸浮培養擴增細胞的工藝，其培養過程是：植物帶休眠芽莖段，插入到適宜固體培養基上，在合適的培養溫度和光照強度下，待愈傷組織長出后，將愈傷組織剝離，置于相同的上述培養基上擴增，擴增后將愈傷組織進行勻漿酶解、研磨或噴霧等理化手段分解為單細胞懸液，置于搖床上以90-120轉/分進行震蕩懸浮培養，每瓶按適當接種率接種，根據生長情況繼代；經數次繼代適應懸浮培養后，轉入大規模生物反應器中進行連續擴增10-25天，待達到生長密度后，通過調節生物反應器中的指標、光源強度及比例、更換培養基成分、以及分批在線收集等手段，最終達到每20-60天收獲一次，或者連續、半連續收獲，比生物生長速率達9-50毫克/克·天，并保持常年穩定擴增的從20L-噸級單元的大規模植物細胞懸浮培養連續擴增體系。

附圖說明

具體操作為：

植物帶休眠芽莖段，插入到適宜固體培養基上，在合適的培養溫度和光照強度下，待起始胚狀體長出后，將胚狀體剝離，或待愈傷組織形成后直接剝離愈傷組織，經勻漿酶解、研磨或噴霧等理化手段分解為單細胞懸液，置于相同的上述培養基上擴增，擴增后轉入到上述培養基去掉瓊脂粉的液體培養基中，置于搖床上90-120轉/分振蕩懸浮培養，獲得細胞種子；將細胞種子按一定接種比例接種到生物反應器中，通過調節氧含量在30-50％之間，pH為5-7，固定光源光照12-20h，光照強度2000-8000Lx，培養分階段進行，每一階段為10-15天，不同階段的光質交替變換，所述的光質為紅藍光，所述的交替變換為紅藍光比例由第一階段的2-3:4-5調整為第二階段的3-4:4-6，再由第二階段的3-4:4-6調整為第三階段的2-3:4-5，并以此模式循環；每階段更換新鮮液體培養基一次。每15-25天收獲石斛胚狀體培養物的30-50％，并補充相應比例的新鮮液體培養基，培養持續進行；所述液體培養基為基本培養基中添加植物生長調節劑，植物生長調節劑為生長素、細胞分裂素的組合或生長素、細胞分裂素與ABA的組合，總濃度為在0.05-5mg/L調整。

所述基本培養基為MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White或SH培養基。