[發明專利]一種AaPDR2基因啟動子及其功能驗證方法和應用

有效

• 申請號: 201610305771.0
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN105779456B
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 唐克軒;何倩;劉萌;石璞;付雪晴;郝小龍;黎凌;孫小芬
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;C12Q1/6897;A01H5/00
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明涉及一種AaPDR2基因啟動子及其功能驗證方法和應用。該AaPDR2基因啟動子包括以下順式作用元件：ABRE、Box I、CAAT?box、CCAAT?box、CGTCA?motif、G?Box、G?box、GA?motif和TATA?box。進一步地，該AaPDR2基因啟動子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。該AaPDR2基因啟動子具有在青蒿幼葉分泌型和非分泌型腺毛中優勢表達其引導的基因的功能，該功能通過GUS報告基因得到證實。因而本發明對利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種AaPDR2基因啟動子及其功能驗證方法和應用。

背景技術

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有過氧橋的倍半萜內酯氧化物——青蒿素，是目前應用最廣泛，療效最好的抗瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，青蒿素聯合療法(ACTs)是世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法。但青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚無法完全滿足全球的市場需求。青蒿的葉片表面有兩種腺毛：分泌型腺毛(glandular secretory trichome，GST)和非分泌型腺毛(T shape trichome，TST)，兩種腺毛對于植物的生長、發育、防御、花粉傳播等都起到至關重要的作用，與青蒿素含量的高低也密切相關。啟動子是位于結構基因5'端上游的特定核酸序列，能夠調控下游基因的表達，啟動子就像一個“開關”，通過順式作用元件和反式作用因子的相互作用來發揮其特定的功能。

ATP結合盒式(ATP binding cassette，ABC)轉運蛋白是一大類非常多樣化非常特殊的超級家族。大部分ABC轉運蛋白直接參與到各種分子的跨膜運輸。AaPDR2是從青蒿中克隆得到的一個ABC轉運蛋白中多藥耐藥(Pleiotropic drug resistance，PDR)亞家族的轉運蛋白。啟動子一共分三種：組成型啟動子、特異型啟動子、誘導型啟動子。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的啟動子大多數是組成型啟動子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)，這類啟動子能夠驅動基因在植物所有的組織和器官中表達，會導致植物體內代謝的浪費，還可能對植物的正常生長造成一定的負擔和危害。因此，克隆青蒿多藥耐藥轉運蛋白2(AaPDR2)基因啟動子對利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。經對現有技術文獻的檢索發現，尚未發現有與本發明的AaPDR2基因啟動子序列相關的報道。

因此，本領域的技術人員致力于開發一種青蒿腺毛優勢表達的基因(AaPDR2)啟動子。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種中青蒿特定部位優勢表達的啟動子。本發明涉及基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、代謝產物檢測。

本發明提供一種AaPDR2基因啟動子，所述AaPDR2基因啟動子的DNA序列包括以下順式作用元件：ABRE、Box I、CAAT-box、CCAAT-box、CGTCA-motif、G-Box、G-box、GA-motif和TATA-box。以上順式作用元件的詳細描述見表1。

表1 AaPDR2基因啟動子序列中的順式作用元件分析

進一步地，所述AaPDR2基因啟動子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明還提供一種如上所述的AaPDR2基因啟動子的功能驗證方法，包括以下步驟：

步驟一、培養青蒿無菌苗；

步驟二、提取所述步驟一中培養的青蒿無菌苗基因組，以此克隆所述AaPDR2基因啟動子；

步驟三、分析調控基因在所述AaPDR2基因啟動子上面的順式作用元件，確定所述AaPDR2基因啟動子的類型；