[發明專利]一種AaPDR2基因啟動子及其功能驗證方法和應用

有效

• 申請號: 201610305771.0
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN105779456B
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 唐克軒;何倩;劉萌;石璞;付雪晴;郝小龍;黎凌;孫小芬
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;C12Q1/6897;A01H5/00
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種AaPDR2基因啟動子，其特征在于，所述AaPDR2基因啟動子的DNA序列包括以下順式作用元件：ABRE、Box I、CAAT-box、CCAAT-box、CGTCA-motif、G-Box、G-box、GA-motif和TATA-box，所述AaPDR2基因啟動子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種如權利要求1所述的AaPDR2基因啟動子的功能驗證方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、培養青蒿無菌苗；

步驟二、提取所述步驟一中培養的青蒿無菌苗基因組，以此克隆所述AaPDR2基因啟動子；

步驟三、分析調控基因在所述AaPDR2基因啟動子上面的順式作用元件，確定所述AaPDR2基因啟動子的類型；

步驟四、將克隆到的所述AaPDR2基因啟動子通過酶切連接連入pCAMBIA1391z載體中，得到1391Z-proAaPDR2載體；

步驟五、將所述1391Z-proAaPDR2載體轉化根癌農桿菌，得到1391Z-proAaPDR2載體的根癌農桿菌工程菌；

步驟六、將所述1391Z-proAaPDR2載體的根癌農桿菌工程菌轉化青蒿，得到轉基因青蒿植株；

步驟七、PCR檢測所述轉基因青蒿植株；

步驟八、確定所述AaPDR2基因啟動子所引導的GUS報告基因在植株中的表達部位；

其中，所述pCAMBIA1391z載體上帶有GUS報告基因。

3.如權利要求2所述的AaPDR2基因啟動子的功能驗證方法，其特征在于，所述步驟二中克隆所述AaPDR2基因啟動子的具體方法是：以所述青蒿無菌苗基因組為模板，采用兩輪巢式PCR方法擴增AaPDR2基因啟動子；其中第一輪所用到的引物對為：AaPDR2-PF1：ATGGTATTAGTCTTCGTGGTCAAC和AaPDR2-PR1：TTGGTGTGTTTGTTTTTGCCTATTTATG；第二輪所用到的引物對為：AaPDR2-PF2：ACCCTTCATTATCCTCATCAGCAG和AaPDR2-PR2：CTTTATTCCAGTCAGTTCCATCCATTG。

4.如權利要求2所述的AaPDR2基因啟動子的功能驗證方法，其特征在于，所述步驟四中采用PstI酶切位點和BamHI酶切位點雙酶切連接連入pCAMBIA1391z載體，其中在正向引物中引入PstI酶切位點，反向引物中引入BamHI酶切位點；所述正向引物為：Pro-PDR2-PstI-FP：TGCACTGCAGTTGGTGTGTTTGTTTTTGCCTAT；所述反向引物為：Pro-PDR2-BamHI-RP：CGGGATCCTGTTACAAAAGATCAATTGATC。

5.一種如權利要求1所述的AaPDR2基因啟動子在青蒿基因工程育種中的應用。

6.如權利要求5所述的AaPDR2基因啟動子在青蒿基因工程育種中的應用，其特征在于，所述AaPDR2基因啟動子能夠代替組成型啟動子引導外源基因在植物腺毛中表達；所述AaPDR2基因啟動子是誘導型啟動子。

7.一種如權利要求1所述的AaPDR2基因啟動子的應用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)培養青蒿無菌苗；

(2)提取所述步驟一中培養的青蒿無菌苗基因組，以此克隆所述AaPDR2基因啟動子；

(3)將克隆到的所述AaPDR2基因啟動子和外源基因融合構建表達載體；

(4)將所述表達載體轉化根癌農桿菌，得到帶有所述表達載體的根癌農桿菌工程菌；

(5)將所述帶有所述表達載體的根癌農桿菌工程菌轉化青蒿，得到轉基因青蒿植株；

(6)PCR檢測所述轉基因青蒿植株，所述轉基因青蒿植株能夠在所述AaPDR2基因啟動子的引導下在其植物腺毛中表達所述外源基因。