[發明專利]一種結核病基因藥物及其制備方法有效

申請號：	201610303281.7	申請日：	2016-05-10
公開（公告）號：	CN105879058B	公開（公告）日：	2017-11-14
發明（設計）人：	范雄林	申請（專利權）人：	華中科技大學
主分類號：	A61K48/00	分類號：	A61K48/00;A61K38/19;A61P31/06;C12N15/861;C12N7/01;C12N15/19;C07K14/52
代理公司：	華中科技大學專利中心42201	代理人：	曹葆青
地址：	430074 湖北***	國省代碼：	湖北;42
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種結核病基因藥物及其制備方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，更具體地，涉及一種結核病基因藥物及其制備方法。

背景技術

腺病毒(Ad)作為一種常見的基因表達載體，可用于介導外源基因在機體的表達。目前，近25％基因藥物的臨床試驗方案，均是基于重組腺病毒(rAd)構建，顯示其在醫學上的重要地位和安全性；而且，國內、外已經批準用于臨床的四種基因藥物和疫苗中，中國批準的兩種都是以rAd為基礎，并證實其安全性。rAd制備簡單、產生的病毒滴度高，并可以經呼吸道吸入、肌注和局部注射等多種途徑應用。

結核病(Tuberculosis,TB)不僅是目前傳染病中威脅全球人類健康的頭號殺手，而且是嚴重影響全球和中國人民健康的重大公共衛生問題之一。每年全世界TB新發病例960萬，150萬人因TB而死亡。盡管異煙肼、利福平等一線和卡那霉素等二線抗TB藥物在臨床上應用廣泛，但治療周期長達6個月以上，患者的依從性差，導致臨床上結核分枝桿菌(M.tb)對這些藥物的耐藥性較為常見。尤其是耐多藥結核病(MDR-TB)的流行，對TB的有效治療提出顯著挑戰。然而，新型抗TB化學藥物的研制尚不能滿足TB治療的需求。因此，開發基因藥物用于治療TB，具有重要意義和實踐價值。

前期，我們構建了一種表達細胞內顆粒溶素的重組腺病毒，用于TB動物模型的治療，證實其可以直接殺傷寄居在小鼠肺臟巨噬細胞內的M.tb，從而對小鼠TB模型具有治療作用。機體感染M.tb后，主要導致肺臟感染，但仍不清楚M.tb在肺臟的具體寄居部位。盡管M.tb被公認是兼性胞內寄生菌，在體內不僅寄居在細胞內，也可寄居在細胞外，但在不同疾病類型如：原發性TB、MDR-TB或潛伏感染狀況下，尚不清楚M.tb在機體的細胞內、外的寄生情況和數量。前述的重組腺病毒的優勢在于僅對細胞內寄生的M.tb治療有效，但游離在細胞外的M.tb仍可導致疾病。因此，應用前述的重組腺病毒為基礎的TB基因治療藥物的療效仍有待提高。

發明內容

針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種TB基因藥物及其制備方法，其目的在于通過在腺病毒基因組中整合細胞內及細胞外顆粒溶素蛋白表達系統，通過優化劑量比例，同時殺傷細胞內、外的M.tb，從而提供一種高效治療TB的基因藥物，尤其適用于MDR-TB的治療和潛伏感染的防治，由此解決現有技術沒有基于重組腺病毒的TB基因治療藥物的技術問題。

為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種TB基因藥物，所述TB基因藥物以腺病毒為基因表達載體，表達細胞內顆粒溶素蛋白以及細胞外顆粒溶素蛋白，所述細胞內顆粒溶素蛋白以及細胞外顆粒溶素蛋白的表達量在2:8至8:2之間。

優選地，所述TB基因藥物，其腺病毒滴度在10¹⁰PFU/ml至10¹²PFU/ml之間。

優選地，所述TB基因藥物，其包括用于表達細胞內顆粒溶素蛋白的第一重組腺病毒以及用于表達細胞外顆粒溶素蛋白的第二重組腺病毒。

優選地，所述TB基因藥物，其第一腺病毒，其重組腺病毒基因組的E1缺失區整合有用于表達細胞內顆粒溶素蛋白的第一序列，所述第一序列為：

(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或

(2)與序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％值100％編碼相同功能蛋白質的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.1限定的氨基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個氨基酸，表達產物具有與序列SEQ ID No.1表達蛋白具有同等活性的基因序列。

優選地，所述TB基因藥物，其第二腺病毒，其重組腺病毒基因組的E1缺失區整合有用于表達細胞外顆粒溶素的第二序列。

所述第二序列為：

A、由SEQ ID No.2所示的基因序列；或

B、與序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80％值100％編碼相同功能蛋白質的氨基酸序列；或

C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個氨基酸，表達產物具有與序列SEQ ID No.2表達蛋白具有同等活性的基因序列。