[發明專利]一種酶法制備D-塔格糖的方法

有效

• 申請號: 201610299412.9
• 申請日: 2016-05-06
• 公開（公告）號: CN105734092B
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發明（設計）人: 嚴明
• 申請（專利權）人: 江蘇中酶生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12N15/70;C12N15/53
• 代理公司: 北京東方靈盾知識產權代理有限公司 11506
• 代理人: 蘇向銀;熊劍

1.一種酶法制備D-塔格糖的方法，其特征在于包括下列步驟：

(1)單獨構建含有半乳糖醇脫氫酶基因的工程菌以及含有NADH氧化酶基因的工程菌或者構建含有半乳糖醇脫氫酶基因與NADH氧化酶基因共表達的工程菌；

(2)將上述構建的工程菌進行發酵獲得含有半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的整細胞；

(3)以含有半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的整細胞或半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的游離酶為催化劑，在弱堿性條件下，NAD+作為氫受體，催化半乳糖醇制備D-塔格糖；

步驟(3)中催化反應體系是1.5～150g/L的半乳糖醇、50U～5KU的半乳糖醇脫氫酶、70U～8KU的NADH氧化酶和0.05～0.2mmol/L的NAD+，在pH7.5～9.0、反應溫度45～55℃、攪拌轉速180～280rpm以及通氣量1～3VVM條件下反應1～24h，得到D-塔格糖轉化液。

2.根據權利要求1所述的酶法制備D-塔格糖的方法，其特征在于步驟(1)中所述工程菌通過重組DNA技術構建，獲取能以NAD+或NADP+為輔酶，催化半乳糖醇為D-塔格糖的半乳糖醇脫氫酶基因序列，能氧化NADH或NADPH為NAD+或NADP+，產物為水的NADH氧化酶基因序列，構建重組表達載體得到工程菌。

3.根據權利要求2所述的酶法制備D-塔格糖的方法，其特征在于所述表達載體為pUC18、pUC19、pBR322或pET系列，表達系統為大腸桿菌表達系統、酵母表達系統或絲狀真菌表達系統。

4.根據權利要求1所述的酶法制備D-塔格糖的方法，其特征在于所述半乳糖醇脫氫酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述NADH氧化酶基因在Genbank中的收錄號為NC_006449.1。

5.根據權利要求4所述的酶法制備D-塔格糖的方法，其特征在于所述表達載體為pET-28a(+)，所述表達系統為大腸桿菌表達系統，表達宿主菌為大桿菌BL21(DE3)。

6.根據權利要求1至5任一所述的酶法制備D-塔格糖的方法，其特征在于步驟(2)中所述發酵用的為TB培養基：酵母提取物20～30g/L，蛋白胨10～20g/L，NaCl 5～15g/L，葡萄糖1～3g/L，乳糖2～4g/L，所述發酵溫度為20～40℃。

7.根據權利要求6所述的酶法制備D-塔格糖的方法，其特征在于步驟(2)中所述發酵用的為TB培養基：酵母提取物25g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L，乳糖3g/L，所述發酵溫度為30℃。