[發(fā)明專利]一種酶法制備D-塔格糖的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610299412.9
• 申請(qǐng)日: 2016-05-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105734092B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嚴(yán)明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇中酶生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/02
• 分類號(hào): C12P19/02;C12N15/70;C12N15/53
• 代理公司: 北京東方靈盾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11506
• 代理人: 蘇向銀;熊劍

本發(fā)明公開(kāi)了一種酶法制備D?塔格糖的方法，包括1)單獨(dú)構(gòu)建含有半乳糖醇脫氫酶基因的工程菌以及含有NADH氧化酶基因的工程菌或者構(gòu)建含有半乳糖醇脫氫酶基因與NADH氧化酶基因共表達(dá)的工程菌；2)將構(gòu)建的工程菌進(jìn)行發(fā)酵獲得含有半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的整細(xì)胞；3)以含有半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的整細(xì)胞或半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的游離酶為催化劑，在弱堿性條件下，NAD+作為氫受體，催化半乳糖醇制備D?塔格糖。本發(fā)明與傳統(tǒng)依賴L?阿拉伯糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)方法相比，其對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率高(>99.0％)、產(chǎn)物分離容易，并且本發(fā)明的方法中所使用的輔酶循環(huán)系統(tǒng)輔產(chǎn)物為水，對(duì)主產(chǎn)物分離純化無(wú)影響。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種基于半乳糖醇脫氫酶與NADH氧化酶雙酶耦合的D-塔格糖生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

D-塔格糖(D-tagatose)為六碳糖，半乳糖的酮糖形式，果糖的差向異構(gòu)體，其甜度為蔗糖的92，但熱量?jī)H為蔗糖的38％。近年來(lái)，隨著生活水平的提高以及糖尿病、肥胖等疾病的普遍化，將D-塔格糖作為功能性甜味劑以取代蔗糖的呼聲日益高漲。D-塔格糖是天然存在的一種稀有單糖，在喬木分泌的樹(shù)膠中，滅菌后的牛奶、熱可可、奶酪和芝士等中均有發(fā)現(xiàn)，但很難從自然界中大規(guī)模直接獲取。

目前工業(yè)上，D-塔格糖的生產(chǎn)主要采用以堿金屬鹽作為催化劑的化學(xué)法或依賴L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的生物法將D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖。Beadle等于1991年發(fā)明了利用Ca(OH)2異構(gòu)D-半乳糖生產(chǎn)D-塔格糖的工藝，其原料D-半乳糖可以通過(guò)水解乳糖或者更為廉價(jià)的乳清(制作乳制品產(chǎn)生的廢料)得到，工藝成本能被市場(chǎng)接受(Beadle J.R.et al.,WO92-12263,1992)。然而，這種方法的副產(chǎn)物眾多，下游分離困難，同時(shí)伴有嚴(yán)重的廢水污染。1993年，Cheetham等發(fā)現(xiàn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(簡(jiǎn)稱L-AI酶，EC 5.3.1.4)能夠催化D-半乳糖生成D-塔格糖；此后的20多年，通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的L-AI酶進(jìn)行異源表達(dá)、性質(zhì)表征以及基因工程改造，學(xué)者們也已篩選到了多種適應(yīng)工業(yè)上嚴(yán)苛生產(chǎn)條件的L-AI酶。但該項(xiàng)技術(shù)最大的瓶頸問(wèn)題是：轉(zhuǎn)化率受到化學(xué)平衡的限制，D-半乳糖的理論轉(zhuǎn)化率僅在40％左右，需要增加下游分離等配套環(huán)節(jié)，加大了投入也提高了生產(chǎn)成本。

半乳糖醇脫氫酶(galactitol 2-dehydrogenase,EC 1.1.1.16)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在于Aspergillus niger、Burkholderia cepacia、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonassp.等多種微生物中，能以NAD+作為氫受體，將底物半乳糖醇C2位的羥基氧化為酮基生成D-塔格糖。原料半乳糖醇價(jià)格低廉，是木糖醇生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)品()，但這一過(guò)程要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化亟需解決的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)是：1、開(kāi)發(fā)具有工業(yè)化應(yīng)用前景的半乳糖醇脫氫酶及其工程菌；2、建立適用于產(chǎn)業(yè)化放大的輔酶高效原位再生的體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種半乳糖醇脫氫酶基因及其工程菌，該基因編碼的半乳糖醇脫氫酶能催化半乳糖醇與D-塔格糖相互轉(zhuǎn)化，并將其與NADH氧化酶偶聯(lián)建立高效的輔酶再生系統(tǒng)應(yīng)用于D-塔格糖的制備，如圖1所示。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種酶法制備D-塔格糖的方法，包括下列步驟：

(1)單獨(dú)構(gòu)建含有半乳糖醇脫氫酶基因的工程菌以及含有NADH氧化酶基因的工程菌或者構(gòu)建含有半乳糖醇脫氫酶基因與NADH氧化酶基因共表達(dá)的工程菌；

(2)將上述構(gòu)建的工程菌進(jìn)行發(fā)酵獲得含有半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的整細(xì)胞；

(3)以含有半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的整細(xì)胞或半乳糖醇脫氫酶、NADH氧化酶的游離酶為催化劑，在弱堿性條件下，NAD+作為氫受體，催化半乳糖醇制備D-塔格糖。