[發(fā)明專利]一種抑制K-RAS基因表達(dá)的siRNA及其前體和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610292198.4
• 申請(qǐng)日: 2016-05-05
• 公開（公告）號(hào): CN107345230A
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張辰宇;陳熹;梁宏偉;U·烏爾-拉赫曼;曾科
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇命碼生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;A61K31/7088;A61P35/00
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司31266
• 代理人: 崔佳佳,馬莉華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種抑制K-RAS基因表達(dá)的siRNA及其前體和應(yīng)用。

背景技術(shù)

RNA干涉(RNAi)在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，利用具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉默通路中起中心作用，是對(duì)特定信使RNA(mRNA)進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1調(diào)控完成。由于RNA病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等原因,細(xì)胞中出現(xiàn)了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)編碼的蛋白質(zhì)識(shí)別外源dsRNA，當(dāng)dsRNA達(dá)到一定量的時(shí)候，Rde-1引導(dǎo)dsRNA與Rde-1編碼的Dicer(Dicer是一種RNaseIII活性核酸內(nèi)切酶，具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域：Argonaute家族的PAZ結(jié)構(gòu)域，III型RNA酶活性區(qū)域，dsRNA結(jié)合區(qū)域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區(qū))結(jié)合，形成酶-dsRNA復(fù)合體。Dicer切割后形成siRNA，然后，在ATP的參與下，細(xì)胞中存在的一種RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RNA-induced silencing complex RNAi干涉的關(guān)鍵步驟是組裝RISC和合成介導(dǎo)特異性反應(yīng)的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后與靶標(biāo)基因編碼區(qū)或UTR區(qū)完全配對(duì)，降解靶標(biāo)基因，因此說(shuō)siRNA只降解與其序列互補(bǔ)配對(duì)的mRNA。其調(diào)控的機(jī)制是通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)而沉默相應(yīng)靶位基因的表達(dá)，所以是一種典型的負(fù)調(diào)控機(jī)制。siRNA識(shí)別靶序列是有高度特異性的，因?yàn)榻到馐紫仍谙鄬?duì)于siRNA來(lái)說(shuō)的中央位置發(fā)生，所以這些中央的堿基位點(diǎn)就顯得極為重要，一旦發(fā)生錯(cuò)配就會(huì)嚴(yán)重抑制RNAi的效應(yīng)。siRNA作為一種新興的治療技術(shù)，也已經(jīng)以一種前所未有的速度邁進(jìn)了臨床試驗(yàn)階段，

K-RAS是RAS基因家族成員之一，編碼K-RAS蛋白。與腫瘤的生成，增殖，遷移，擴(kuò)散以及血管生成均有關(guān)系。

K-RAS蛋白具有GTPase活性，結(jié)合GTP時(shí)為活化態(tài)，結(jié)合GDP時(shí)為失活態(tài)。主要定位于細(xì)胞膜上，PKC使K-RAS磷酸化后，這種磷酸化過(guò)程導(dǎo)致K-RAS與細(xì)胞膜的結(jié)合減弱而改變位置，并移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和粒線體等位置。K-RAS具有分子開關(guān)作用，在很多信號(hào)通路中具有重要作用。

研究表明約30％的人類惡性腫瘤與RAS基因突變有關(guān)，RAS突變后的產(chǎn)物可以一直處于活化狀態(tài)。在白血病，肺癌，直腸癌和胰腺癌中，K-RAS突變均很常見(jiàn)，其中直腸癌中30％-35％患者有突變。其與腫瘤細(xì)胞的生存，增殖，遷移，擴(kuò)散，血管生成均有關(guān)系。K-RAS基因分為突變型和野生型，常見(jiàn)突變位點(diǎn)為K-RAS基因2號(hào)外顯子的12號(hào)密碼子和13號(hào)密碼子上，3號(hào)外顯子的61號(hào)密碼子，其中有7個(gè)突變熱點(diǎn)：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V/D.這7種突變占到了90％以上。

目前市面上的EGFR的靶向藥物主要有：吉非替尼Gefitinib(易瑞沙，Iressa)，厄羅替尼erlotinib(特羅凱，Tarceva)，西妥昔單抗Cetuximab(愛(ài)必妥，ERBITUX)、帕尼單抗panitumumab(Vectibix)。但是EGFR靶向藥物對(duì)于K-RAS突變型患者療效很差，因?yàn)闆](méi)有EGFR的信號(hào)，K-RAS也處于活化狀態(tài)向下游傳遞信號(hào)，故在個(gè)性要用藥中要先檢測(cè)K-RAS基因狀態(tài)再選擇用藥。若K-RAS為突變型則不建議使用EGFR靶向藥物。

因此，考慮到如果可以同時(shí)靶向EGFR和K-RAS通路，則可以進(jìn)而同時(shí)抑制通路的上下游，從而使EGFR靶向藥物對(duì)K-RAS突變患者產(chǎn)生更好的治療效果，因此，目前急缺一種可以靶向抑制K-RAS基因的治療方法及對(duì)應(yīng)的藥物，以解決目前尚無(wú)藥物特異性針對(duì)K-RAS突變、以及K-RAS突變導(dǎo)致EGFR靶向藥物無(wú)效等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種新的抑制K-RAS基因的siRNA、其前體，及其在治療腫瘤中的應(yīng)用。

本發(fā)明第一方面，提供了一種前體序列，其特征在于，其5’至3’端具有式I所示的結(jié)構(gòu)：

B1為所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括K-RAS siRNA正義鏈序列；

B2為與B1基本互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的序列，且B2與C不互補(bǔ)；