[發明專利]一種重組人胰島素結晶的制備方法

在審

• 申請號: 201610289803.2
• 申請日: 2016-05-05
• 公開（公告）號: CN105753966A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 冷春生;李樹鵬;孟祥成;賈冰;楊旭;常曉慧
• 申請（專利權）人: 通化東寶藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/30
• 代理公司: 北京遞進知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11414
• 代理人: 田豐

1.一種重組人胰島素結晶的制備方法，其特征在于，所述方法由以下步驟組成：

1)將含有重組人胰島素的反向高效層析液，加入鋅鹽溶液，使每OD₂₈₀nm的重組人胰島素中含有鋅離子的濃度為10-55mg/ml,加入低溫純化水，當胰島素溶液濃度稀釋到0.5-6mg/ml時，攪拌；

2)向步驟1)中胰島素溶液加入3-5M的氨水進行調沉，直到pH為5.5-7.5之間時，停止攪拌，得到一次結晶液；將一次結晶液轉移至一結結晶罐中靜置沉降，沉降后，測定上清液OD₂₈₀nm小于等于0.2時，排除上清液,得到一結結晶；

3)將一結結晶轉移到二結調沉罐中，向二結調沉罐中加入1-3M醋酸進行溶解，攪拌，待一結結晶完全溶解后停止添加醋酸和攪拌，然后向罐中補入常溫純化水，使其稀釋濃度為3-18mg/ml；

4)繼續攪拌，待溶液攪拌均勻后進行調沉，向罐中加入3-5M氨水調節溶液pH值至5.5-7.5，停止攪拌，觀察晶體，待晶體形成后，得到二次結晶液；將二次結晶液轉移至二結結晶罐中靜置沉降，沉降后，測定上清液OD₂₈₀nm值小于等于0.2時，將上清液排掉；得到二結結晶；

5)向二結結晶罐中加入常溫純化水,攪拌，加入1-3M醋酸，待結晶完全溶解后停止添加醋酸和攪拌；

6)向步驟5)的二結結晶罐中補加鋅鹽溶液，使其鋅離子濃度為0.3-1.6×10^—4mg/ml，攪拌均勻后，經無菌濾芯過濾后，轉移至已經滅菌的三結調沉罐中；

7)向三結調沉罐中加入常溫注射用水，稀釋濃度范圍為3-18mg/ml，攪拌；

8)向步驟7)的三結調沉灌中加入3-5M氨水溶液調節溶液pH值，當溶液pH值調至5.5-7.5后，觀察晶體，待晶體形成后，得到三次結晶液；將三次結晶液轉移至三結結晶罐中，靜置沉降，過濾，得到重組人胰島素結晶。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述鋅鹽溶液為氯化鋅；低溫純化水溫度為2-8℃；胰島素溶液稀釋到4mg/ml。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)，調節pH為5.5-6.5，攪拌的速度為50-100轉/分鐘；沉降時間為大于等于10小時；沉降后，測定上清液OD₂₈₀nm小于等于0.1時，去除上清液,得到一結結晶。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述打開攪拌器后，攪拌速度50-100轉/分鐘，所述常溫純化水的溫度為20-25℃。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述一次結晶溶解液的稀釋濃度范圍為5mg/ml。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4)，所述pH5.5-6.5，所述二結結晶罐中二次結晶液沉降大于等于10小時；沉降后，測定上清液OD₂₈₀nm值小于等于0.1時，將上清液排掉；得到二結結晶。

7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5)加入常溫純化水的溫度為20-25℃；加入純化水的量使重組人胰島素樣品的濃度至25-60mg/ml。

8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟6)所述鋅濃度1.5×10^—4mg/ml，所述過濾為使用0.22μm的無菌濾芯過濾。

9.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟7)重組人胰島素二結結晶溶解液的稀釋濃度范圍為5mg/ml。

10.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟8)，所述pH為5.5-6.5，靜置沉淀大于等于10小時，使用0.22μm的無菌濾芯進行過濾。