[發明專利]一種重組人胰島素結晶的制備方法

在審

• 申請號: 201610289803.2
• 申請日: 2016-05-05
• 公開（公告）號: CN105753966A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 冷春生;李樹鵬;孟祥成;賈冰;楊旭;常曉慧
• 申請（專利權）人: 通化東寶藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/30
• 代理公司: 北京遞進知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11414
• 代理人: 田豐

技術領域

本發明屬于一種重組人胰島素結晶的制備方法，具體涉及一種重組人胰島素三次結晶的制備方法，屬于蛋白質結晶技術領域。

背景技術

糖尿病是多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，是由于體內胰島素絕對或相對缺乏或靶組織對胰島素不敏感而引起的綜合病癥。近年來，隨著人們生活水平的改善，糖尿病的發病率呈現出逐年上升的趨勢，成為僅次于心血管和腫瘤的第三大致死疾病。糖尿病及其并發癥的發生，不僅給患者帶來極大的痛苦，還給個人、家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。使用胰島素是使糖尿病患者血糖達標的重要手段。

結晶是胰島素及其類似物原料藥生產的重要環節，然而現有技術中胰島素及其類似物的結晶過程中大多均需添加酚類物質(申請號如：201510334795.4、201510176512.8)、有機溶劑(例如乙腈、乙醇等)、除鋅離子以外的其他陽離子，如鈉離子(ZL02113186.4)，這些揮發性差和/或毒性高的化學物質的殘留會嚴重影響胰島素終產品的質量。例如苯酚是一種有毒溶劑，揮發性較差，有強腐蝕性，對皮膚、粘膜有強烈的腐蝕作用，同時還會抑制中樞神經系統或損害肝、腎功能等。胰島素及胰島素類似物市場巨大，目前未有胰島素結晶或胰島素類似物結晶過程中無需添加酚類物質、有機溶劑就可成功獲得結晶的相關報道。

因此，無論是在臨床需要，還是工業生產上，迫切需要一種人胰島素結晶的制備方法，無需加入酚類及其衍生物、有機溶劑、鈉離子等試劑，能夠得到一種顆粒大、沉降速度快、便于分離、雜質低殘留的人胰島素結晶，所得的人胰島素結晶純度要高，便于工業生產。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種重組人胰島素結晶的制備方法，該方法具有以下優點：

在結晶過程中不需要加入鈉離子、酚類物質和有機溶劑就能夠成功制備出重組人胰島素結晶。

所述方法由以下步驟組成：

1)將含有重組人胰島素的反向高效層析液，加入鋅鹽溶液，使每OD₂₈₀nm的重組人胰島素中含有鋅離子的濃度為10-55mg/ml,加入低溫純化水，當胰島素溶液濃度稀釋到0.5-6mg/ml時，攪拌；

2)向步驟1)中胰島素溶液加入3-5M的氨水進行調沉，直到pH為5.5-7.5之間時，停止攪拌，得到一次結晶液；將一次結晶液轉移至一結結晶罐中靜置沉降，沉降后，測定上清液OD₂₈₀nm小于等于0.2時，排除上清液,得到一結結晶；

3)將一結結晶轉移到二結調沉罐中，向二結調沉罐中加入1-3M醋酸進行溶解，攪拌，待一結結晶完全溶解后停止添加醋酸和攪拌，然后向罐中補入常溫純化水，使其稀釋濃度為3-18mg/ml；

4)繼續攪拌，待溶液攪拌均勻后進行調沉，向罐中加入3-5M氨水調節溶液pH值至5.5-7.5，停止攪拌，觀察晶體，待晶體形成后，得到二次結晶液；將二次結晶液轉移至二結結晶罐中靜置沉降，沉降后，測定上清液OD₂₈₀nm值小于等于0.2時，將上清液排掉；得到二結結晶；

5)向二結結晶罐中加入常溫純化水,攪拌，加入1-3M醋酸，待結晶完全溶解后停止添加醋酸和攪拌；

6)向步驟5)的二結結晶罐中補加鋅鹽溶液，使其鋅離子濃度為0.3-1.6×10^—4mg/ml，攪拌均勻后，經無菌濾芯過濾后，轉移至已經滅菌的三結調沉罐中；

7)向三結調沉罐中加入常溫注射用水，稀釋濃度范圍為3-18mg/ml，攪拌；

8)向步驟7)的三結調沉灌中加入3-5M氨水溶液調節溶液pH值，當溶液pH值調至5.5-7.5后，觀察晶體，待晶體形成后，得到三次結晶液；將三次結晶液轉移至三結結晶罐中，靜置沉降，過濾，得到重組人胰島素結晶。

步驟1中，所述樣品為重組人胰島素的反向高效層析液，反相高效層析，是我們將得到的粗產品精純的過程，是將粗產品經反相高效層析后得到的，內含成分就是重組人胰島素、乙腈和醋酸銨，使用紫外分光法對重組人胰島素濃度進行測定，使用紫外光n＝280nm，測定相應的OD280nm值，而經過我們的計算，1OD280nm對應的重組人胰島素的濃度為1.1mg/ml。

步驟1)為加入鋅離子，稀釋溶液，因為通過高效色譜進行純化時，高濃度的重組人胰島素層析液含有很多流動相物質，例如乙腈等，不利于沉淀，需進行稀釋。

步驟2和4中的調沉，目的是為了促進沉淀。

加入低溫純化水，可以保持蛋白質的質量水平。