[發(fā)明專利]一種采用鈣黃綠素標(biāo)記斑馬魚(yú)胃腸道的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610286065.6
• 申請(qǐng)日: 2016-05-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105709242B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫晨;韓建;韓利文;王雪;王榮春;侯海榮;陳錫強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省科學(xué)院生物研究所
• 主分類號(hào): A61K49/00
• 分類號(hào): A61K49/00
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發(fā)明涉及一種采用鈣黃綠素標(biāo)記斑馬魚(yú)胃腸道的方法。該方法步驟如下：(1)挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎，放入含有培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，加入鈣黃綠素溶液；(2)恒溫條件下避光孵育斑馬魚(yú)胚胎，然后用培養(yǎng)液清洗，制得標(biāo)記后的斑馬魚(yú)胚胎；(3)將標(biāo)記后的斑馬魚(yú)胚胎麻醉，利用圖像采集工具，對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中顯示黃綠熒光的胃腸道部分進(jìn)行影像采集并保存。本發(fā)明首次對(duì)鈣黃綠素標(biāo)記斑馬魚(yú)胃腸道的影響因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)鈣黃綠素標(biāo)記斑馬魚(yú)胃腸道的影響因素與在骨骼沉積等方式進(jìn)行染色的影響因素不相同，通過(guò)對(duì)相關(guān)條件進(jìn)行優(yōu)化后，獲得了能夠得到胃腸道輪廓清晰、清楚可見(jiàn)、易于辨識(shí)的結(jié)果的標(biāo)記方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種采用鈣黃綠素標(biāo)記斑馬魚(yú)胃腸道的方法，屬于藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

胃腸道是人體最大的免疫器官，也是人體最大的排毒器官。胃腸道指的是從胃幽門至肛門的消化管。腸是消化管中最長(zhǎng)的一段，也是功能最重要的一段。自改革開(kāi)放以來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日趨激烈，人們生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增大而導(dǎo)致的胃腸道類疾病問(wèn)題日漸普遍。截止目前為止，該類疾病已成為臨床的常見(jiàn)病和多發(fā)病，總發(fā)病率約占總?cè)丝诘?0％左右；年齡越大，該類疾病的發(fā)病率越高，且男性高于女性，如不及時(shí)治療，長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，胃腸道類疾病極易轉(zhuǎn)化為癌腫。胃腸類疾病歷來(lái)被醫(yī)家視為疑難之癥，該類疾病越早被發(fā)現(xiàn)，患者的治愈率也將越高。因此以快速且有效的方法對(duì)活體模式生物的胃腸道進(jìn)行特異性標(biāo)記，將有助于胃腸道類疾病的早期診斷和特效藥物的研發(fā)，也具有非常重要的社會(huì)效益和廣闊的市場(chǎng)前景。

目前在人口健康領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的模式生物包括噬菌體、秀麗隱桿線蟲(chóng)、果蠅、斑馬魚(yú)和小鼠等。其中由于噬菌體、秀麗隱桿線蟲(chóng)和果蠅等模式生物與人類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；在基因水平及組織器官構(gòu)成等方面，它們與人類也有著較大的差距；因此通常不利用以上三種模式生物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)胃腸道進(jìn)行研究。小鼠是一種小型嚙齒類的哺乳動(dòng)物，雖然在進(jìn)化上與人類的距離較近，且解剖結(jié)構(gòu)和發(fā)育過(guò)程等也與人類接近。但是由于小鼠屬于體內(nèi)受精、體內(nèi)發(fā)育，且繁育周期較長(zhǎng)。因此以其作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)胃腸道進(jìn)行特異性標(biāo)記及研究時(shí)，通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力。小鼠胃腸道被特異性標(biāo)記后，其結(jié)果的觀察只能是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后，在體外進(jìn)行；或是利用影像技術(shù)間接觀察活體小鼠的胃腸道。以上過(guò)程均周期較長(zhǎng)且成本較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏直觀性。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN103301480A(申請(qǐng)?zhí)?01310181252.4)公開(kāi)了一種斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)模型的建立方法及篩選促胃腸動(dòng)力藥物的方法，包括(1)斑馬魚(yú)選?。?2)模型誘導(dǎo)及化合物處理；(3)熒光顯微鏡定量分析。該方法選擇斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用尼羅紅作為染料標(biāo)記其胃腸道。但是該方法優(yōu)選的標(biāo)記時(shí)間為16h，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。

鑒于以上研究方法的不足，建立一個(gè)可快速、特異性對(duì)活體模式生物胃腸道進(jìn)行標(biāo)記的方法；使得既縮短實(shí)驗(yàn)周期、降低研究成本，又能增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察的可靠性和直觀性是目前亟待解決的技術(shù)難題。

斑馬魚(yú)(Daniorerio)是源自印度、巴基斯坦淡水河流中的一種小型熱帶淡水魚(yú)，屬于鯉科，是生命科學(xué)領(lǐng)域的重要脊椎動(dòng)物之一，現(xiàn)已被美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院列為繼人和小鼠之后的第三大模式生物。在基因組水平上，斑馬魚(yú)與人類具有高達(dá)87％的同源性，約70％的人類基因在斑馬魚(yú)中至少有一個(gè)明顯的同源基因。在生理結(jié)構(gòu)、信號(hào)通路傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)功能等方面，斑馬魚(yú)與人類相比也表現(xiàn)出很高的保守性。與小鼠相比，斑馬魚(yú)體外受精、體外發(fā)育、胚胎透明，整個(gè)發(fā)育過(guò)程清晰可見(jiàn)，且產(chǎn)卵量高，發(fā)育周期短。因此以斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)胃腸道進(jìn)行特異性標(biāo)記及研究，既經(jīng)濟(jì)又快速，且結(jié)果直觀，易于觀察。

在胃腸道的細(xì)胞功能和解剖結(jié)構(gòu)等方面，斑馬魚(yú)與人類非常相似，均由內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織、環(huán)狀肌和外縱肌組成。斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至26-126hpf，其腸道的管腔形成，并不斷生長(zhǎng)，功能性腸道上皮由內(nèi)胚層逐漸分化形成。斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至72hpf，在未喂食狀態(tài)下，其腸道首次出現(xiàn)不穩(wěn)定的自發(fā)性收縮。伴隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，至120-144hpf，斑馬魚(yú)胚胎的大部分卵黃囊被吸收，腸道自發(fā)的蠕動(dòng)及攝食能力增強(qiáng)。由于斑馬魚(yú)胚胎體外發(fā)育且透明，因此在早期發(fā)育階段，其胃腸道均易于觀察。