[發明專利]一種基于疏水柱的烏司他丁純化方法

在審

• 申請號: 201610280471.1
• 申請日: 2016-04-28
• 公開（公告）號: CN105753975A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 王旭;鄭少亮;許文勤;肖益熱
• 申請（專利權）人: 廣東天普生化醫藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/20
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種基于疏水柱的烏司他丁純化方法。

背景技術

烏司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制劑(Urinarytrypsininhibitor，簡稱為UTI)是一種從人尿中分離純化的由143個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在2.6左右，分子量67000Da左右，具有抑制多種蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性；從而抑制炎癥介質的過度釋放；改善微循環和組織灌注。而在機體受到嚴重損傷時起抑制全身性炎癥反應(SIRS)的發生發展、繼而阻斷多臟器功能障礙(MODS)，保護臟器功能等作用。

人尿中含有三百多種蛋白質，目前已開發提取的主要有尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶等，這些組分在臨床上具有重要的治療價值。

人尿激肽原酶(UrinaryKallidinogenase，簡稱為KN)，是從人尿中分離提取的一種由238個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在4左右，分子量約54000D左右，屬于絲氨酸蛋白酶。它能夠激活人血漿激肽原轉化為激肽。目前，已經被開發成用于治療急性腦梗死的藥物。

目前臨床使用的烏司他丁產品，由于存在雜蛋白及一些有色基團，導致其效價低，穩定性不好，特別是存在少量人尿激肽原酶(KN)而使產品有潛在的副作用。尤其是KN和UTI，二者分子大小相近，且均為酸性蛋白，常規的純化方法對其較難分離，后續純化困難。

目前國內純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法主要為經典的氣泡提取法結合親和層析、離子交換法、親和層析法、分子篩層析、金屬螯合層析和疏水層析法等，以及尿胰蛋白抑制劑和尿激肽釋放酶聯產工藝，這些方法由于純化方法吸附效率低，往往需要結合多步層析，造成工藝步驟多，產品收率低，生產周期長，不易放大；另外，多步層析使用的純化介質成本昂貴，不利于工業生產。特別是針對分離除去人尿激肽原酶(KN)的純化技術還是靠反復的層析，對產品損失比較大。因此，除掉人尿激肽原酶(KN)及其他雜質進一步提高烏司他丁的質量是十分必要的，也是急需待解決的問題。

發明內容

本發明的目的是克服現有烏司他丁純度不高、收率過低、不穩定的缺陷，采用基于疏水柱層析來純化烏司他丁，從而提高了烏司他丁收率和純度。提供了一種基于疏水柱的烏司他丁純化方法。

近年來，隨著疏水層析介質在蛋白分離中應用的研究，和對人尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶的疏水特性的研究發現，利用疏水層析柱的特殊吸附性可一步純化人尿胰蛋白酶抑制劑。

為了解決上述的技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現：

將烏司他丁粗品經過前處理，通過疏水柱層析進行純化，洗脫液超濾，即得高純度的烏司他丁，所得純化后的烏司他丁總收率提高到75％以上，產品比活達到4000U/mg·pr以上。

所述的疏水柱層析包括以下步驟：

1)前處理：將烏司他丁粗品溶解在水中，以質量g/體積ml計，烏司他丁∶水為1∶2，再用硅藻土過濾，收集濾液，加入ZnCl₂使其終濃度為150mmol/L，用預冷的95％乙醇沉淀，用量以體積ml/ml比計，樣品溶解液體積∶95％乙醇體積為1∶1.1，攪拌30min，板框過濾，取上清液，調電導50～55ms/cm，冰醋酸調pH4.0；樣品溶解液體積∶95％乙醇體積為1∶2.3，攪拌30min，板框過濾，取沉淀物后，將沉淀物溶解于3倍體積的水。

2)上樣及洗滌：用pH3.5～4.5，1.5～2.0mol/L(NH₄)₂SO₄－0.05～0.15mol/L醋酸緩沖液平衡層析柱，上樣，上樣溶液的蛋白濃度為25～30mg/mL膠，用pH3.5～4.5，1.5～2.0mol/L(NH₄)₂SO₄－0.05～0.15mol/L醋酸緩沖液洗滌；

3)洗脫：用pH4.0～6.0、0.08mol/L磷酸鹽緩沖液－0.4mol/L氯化鈉溶液進行洗脫；洗脫液用超濾膜超濾，即得純化的烏司他丁原料藥。

所述的疏水柱介質選自：PhenylBio-sepFF、PhenylBio-sepHP和ButylBio-sepHP中的一種。

所述的洗滌液優選pH值為4.0的1.5mol/L(NH₄)₂SO₄－0.1mol/L醋酸緩沖液。

所述的洗脫液優選pH值為5.5的0.08mol/L磷酸鹽緩沖液－0.4mol/L氯化鈉溶液。