[發明專利]三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒及其操作方法

有效

• 申請號: 201610277466.5
• 申請日: 2016-04-28
• 公開（公告）號: CN105695639B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 黃文;任春華;趙哲;胡超群;王艷紅;陳廷;江曉;羅鵬
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發明公開了三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒及其操作方法。本發明試劑盒包括：PBS預處理液、RNA快速提取液和檢測液。本發明采用了快速提取RNA的方法，加上預混檢測液、試劑一次性使用等設計，通過簡化的三步操作即可完成病毒檢測，檢測過程不易被污染，可操作性強。本發明設計的試劑盒檢測結果可視化，適用于無專業知識的基層工作人員，可用于防控石斑魚諾達病毒的流行，應用前景廣泛，適合商業化生產。

技術領域

本發明屬于病毒分子生物學檢測技術領域，具體涉及三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒及其操作方法。

背景技術

石斑魚(Grouper)隸屬于鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)，是我國南方沿海各省及東南亞各國最重要的海水養殖魚類之一，其肉質鮮美、營養價值高，經濟價值較大。石斑魚黑身病是限制石斑魚養殖業可持續發展的最重要病害之一，發病后最高死亡率可達100％，給該產業造成了巨大的損失。

β諾達病毒(Betanodavirus)是世界范圍內的一種魚類流行性傳染病，已在歐洲海鱸(Lateolabrax japonicus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、黃帶擬鲹(Pseudocaranxdentex)等40多種海水魚類中報道出現了該病毒疫情，給包括石斑魚(Grouper，Epinephelinae)在內的多種海水魚類養殖業帶來了巨大的損失。β諾達病毒也被稱為神經壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，是引起石斑魚病毒性神經壞死病(Viralnervous necrosis，VNN)或病毒性腦及視網膜病(Viral encephalopathy andretinopathy，VER)的病原，能夠導致石斑魚稚、幼苗大規模急性死亡。

加強病毒檢疫、提前阻斷病毒傳播，是防控病毒類疾病的重要方法。隨著生物技術的發展，已經發展出了多種能夠提前檢測病毒的方法，如細胞培養、熒光抗體、免疫組織化學、PCR等技術。環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal Amplification，LAMP)是一種新型的PCR技術，通過設計4條特異、高效的引物，能夠在等溫條件下不間斷地快速擴增目的序列，具有快速、靈敏、特異性高的優點。

但是，現行的LAMP試劑盒及檢測方法具有組份復雜、操作繁瑣、對檢測人員技術要求高等不利因素，極大地限制了LAMP試劑盒的應用。特別是RNA病毒的檢測，需要經過RNA提取、反轉錄、LAMP反應等多個環節。現行的RNA提取方法就需要經歷Trizol抽提、氯仿分層、異丙醇抽提離心、100％乙醇、75％乙醇、DEPC水溶解RNA等多個步驟，再加上反轉錄、LAMP反應引物、酶、反應緩沖液添加等各種步驟，反應試管需要多次開蓋添加試劑，導致多數的基層技術人員無法完成，即使完成，LAMP反應也極易被污染出現假陽性結果。

因此，開發出一種操作步驟少、簡單有效、無污染的石斑魚β諾達病毒快速檢測技術具有重要的應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種無需特殊設備、快速有效、能夠應用于養殖現場的三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒(Betanodavirus)的試劑盒及其操作方法。

本發明的三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：PBS預處理液、RNA快速提取液和檢測液。

優選，所述的檢測液含有AMV逆轉錄酶、RNase抑制劑、核酸熒光染料、環介導等溫擴增試劑和β諾達病毒的檢測引物組。