[發明專利]三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒及其操作方法

有效

• 申請號: 201610277466.5
• 申請日: 2016-04-28
• 公開（公告）號: CN105695639B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 黃文;任春華;趙哲;胡超群;王艷紅;陳廷;江曉;羅鵬
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：PBS預處理液、RNA快速提取液和檢測液；

所述的PBS預處理液是pH7.2±0.2的PBS溶液；

所述的RNA快速提取液是Epicentre Biotechnologies公司QuickExtract^TM RNAExtraction Solution型號的試劑；

所述的檢測液為環介導等溫擴增反應液，其每20μl體系中含有：8-10U/μl Bst 2.0聚合酶1μl，1-2U/μl AMV逆轉錄酶1μl，15-20U/μl RNase抑制劑1μl，1.0-2.0mM dNTPs 3.5μl，10×Amplification Buffer 2.5μl，6-8mM MgSO₄ 1.5μl，1M甜菜堿5μl，10×SYTO-9染料0.5μl，0.2μM上游外引物F₃ 1μl，0.2μM下游外引物B₃ 1μl，1.6μM上游內引物FIP 1μl，1.6μM下游內引物BIP 1μl；其中，10×Amplification Buffer含有200mM Tris-HCl、100mM(NH₄)₂SO₄、500mM KCl、20mM MgSO₄和1％Tween 20，PH 8.8；

上游外引物F₃為：5’-GGTGCAGTCGTTGCCAAAT-3’，

下游外引物B₃為：5’-CGACATAGCACCGACACG-3’，

上游內引物FIP為：5’-TCCTTTCCCGACGAGGTCCAGGTGGGAAAGCAGTACAGTCC-3’，

下游內引物BIP為：5’-AGCGTCTCACGTCACCTGGTACCACATCGGTGTTGTTGC-3’。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測液所包含的組份已提前混合；所述的RNA快速提取液是直接分裝而成的；所述的PBS預處理液、RNA快速提取液及檢測液都為可直接使用的工作液。

3.一種非疾病的診斷和治療目的的三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒的操作方法，其特征在于，其是利用權利要求1所述的試劑盒進行檢測，具體包括以下步驟：第一步，樣品預處理：將樣品于PBS預處理液中處理，制備成10³-10⁶個/mL的細胞懸浮液；第二步，RNA快速提?。涸賹⒓毎麘腋∫杭尤氲絉NA快速提取液中進行病毒RNA提取得到總RNA溶液；第三步，病毒檢測：然后將總RNA溶液加入到檢測液中，置于63-68℃的水浴下保溫1-1.5h；若檢測液顏色發生改變，則說明樣品中含有β諾達病毒；若檢測液顏色未發生改變，則說明樣品中不含有β諾達病毒。

4.根據權利要求3所述的操作方法，其特征在于，所述的將細胞懸浮液加入到RNA快速提取液中是取8～15微升的10³-10⁶個/mL的細胞懸浮液加入到100-200μl的RNA快速提取液中，并充分振蕩1-3min，制成總RNA溶液；所述的將總RNA溶液加入到檢測液中是吸取2-6微升總RNA溶液加入20μl的檢測液中。