[發(fā)明專(zhuān)利]蛋清中硫酸角質(zhì)素的提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610269778.1
• 申請(qǐng)日: 2016-04-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105732838B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉長(zhǎng)國(guó);趙紅娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 劉長(zhǎng)國(guó)
• 主分類(lèi)號(hào): C08B37/00
• 分類(lèi)號(hào): C08B37/00
• 代理公司: 北京中政聯(lián)科專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙)11489
• 代理人: 吳建鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種硫酸角質(zhì)素的提取方法，尤其涉及一種從蛋清中提取硫酸角質(zhì)素的方法。

背景技術(shù)

硫酸角質(zhì)素是一類(lèi)糖胺聚糖，即富含陰離子的直鏈線(xiàn)性大分子多糖。和其它糖胺聚糖一樣，動(dòng)物體內(nèi)硫酸角質(zhì)素能夠和多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞受體以及生化酶相結(jié)合，誘發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡；此外還調(diào)控組織器官中含水量。目前硫酸角質(zhì)素主要被研制成藥物用于眼科疾病治療，如眼睛炎癥、眼睛色素膜炎、眼角膜炎、眼角膜損傷；之外也作為滴眼液主要成分用于眼保健。

目前硫酸角質(zhì)素主要來(lái)自牛眼角膜，產(chǎn)量有限，加上瘋牛病的爆發(fā)，市場(chǎng)上硫酸角質(zhì)素產(chǎn)品尤其缺乏。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種從蛋清中硫酸角質(zhì)素的提取方法，可有效解決上述問(wèn)題。

一種蛋清中硫酸角質(zhì)素的提取方法，其特征在于，包括：

S1，獲取蛋清；

S2，往所述蛋清中加入鏈霉蛋白酶～Actinase E，并保持反應(yīng)溫度為37～39℃，處理12～28小時(shí)以降解所述蛋清中的蛋白質(zhì)；

S3，將步驟S2中的鏈霉蛋白酶～Actinase E滅活；

S4，將步驟S3中獲得的產(chǎn)物用蛋白酶K或堿性蛋白酶～alcalase在53～56℃溫度下處理6～24小時(shí)以進(jìn)一步降解所述蛋清中殘余的蛋白質(zhì)以及滅活的鏈霉蛋白酶～Actinase E；

S5，將步驟S4中的蛋白酶K或堿性蛋白酶～alcalase滅活；

S6，將步驟S5所獲得的產(chǎn)物離心分離，獲取上清液；

S7，從步驟S6獲得的上清液中提取總糖胺聚糖；

S8，將從步驟S7獲得的總糖胺聚糖溶解于水，然后加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III于37℃反應(yīng)12～24小時(shí)以降解總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素，然后加入硫酸軟骨素酶反應(yīng)液以及硫酸軟骨素酶III、硫酸軟骨素酶II于37℃反應(yīng)8～24小時(shí)以降解總糖胺聚糖中的硫酸軟骨素/硫酸皮膚素以及透明質(zhì)酸；

S9，將從步驟S8獲得的產(chǎn)物循環(huán)兩遍加入強(qiáng)效陰離子交換柱(循環(huán)兩遍加樣可以有效提高硫酸角質(zhì)素與陰離子交換柱的結(jié)合，從而提高硫酸角質(zhì)素產(chǎn)率)，或往所述上清液中加入強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合過(guò)夜，上清液與樹(shù)脂體積比為5～80：1；用0.1～0.5M的NaCl洗滌所述強(qiáng)效陰離子交換柱或所述強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂以去除酶解后的糖鏈碎片或其它雜質(zhì)，再用3.3M的NaCl洗脫獲得硫酸角質(zhì)素鹽溶液；隨后，或者用截留量為3～10kDa的超濾管或透析袋洗脫NaCl獲得硫酸角質(zhì)素；或者先用2～5倍體積的甲醇加入硫酸角質(zhì)素鹽溶液，在-20～8℃沉淀硫酸角質(zhì)素12～18小時(shí)，離心，棄含鹽上清，之后用體積濃度70～95v％甲醇洗滌硫酸角質(zhì)素沉淀；最后凍干或空干獲得最終產(chǎn)物硫酸角質(zhì)素。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述鏈霉蛋白酶～Actinase E與所述直接從蛋中分離的液態(tài)蛋清的質(zhì)量比1:50～300。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述冷凍干燥的蛋清或烘干后粉碎的蛋清，先用水或磷酸鹽緩沖液溶解，水或PBS與干燥蛋清的質(zhì)量比為10～50：1，之后加入所述鏈霉蛋白酶～Actinase E，酶與干燥蛋清的質(zhì)量比1:20～100。

優(yōu)選的，將步驟S2中的鏈霉蛋白酶～Actinase E滅活包括：將步驟S2獲得的產(chǎn)物在90～95℃加熱處理10～30分鐘。

優(yōu)選的，步驟S4中，所述蛋白酶K與鏈霉蛋白酶～Actinase E的質(zhì)量比1：5～15，所述堿性蛋白酶～alcalase與鏈霉蛋白酶～Actinase E的質(zhì)量比1：5～20。

優(yōu)選的，將步驟S4中的蛋白酶K或堿性蛋白酶～alcalase滅活包括：將步驟S4獲得的產(chǎn)物在90～100℃加熱處理10～40分鐘。

優(yōu)選的，在步驟S6中，所述將步驟S5所獲得的產(chǎn)物離心分離，通過(guò)懸浮桶轉(zhuǎn)子3200～8000xg離心力實(shí)現(xiàn)。