[發明專利]蛋清中硫酸角質素的提取方法

有效

• 申請號: 201610269778.1
• 申請日: 2016-04-26
• 公開（公告）號: CN105732838B
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 劉長國;趙紅娟
• 申請（專利權）人: 劉長國
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00
• 代理公司: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙)11489
• 代理人: 吳建鋒

1.一種蛋清中硫酸角質素的提取方法，其特征在于，包括：

S1，獲取蛋清；

S2，往所述蛋清中加入鏈霉蛋白酶～Actinase E，并保持反應溫度為37～39℃，處理12～28小時以降解所述蛋清中的蛋白質；

S3，將步驟S2中的鏈霉蛋白酶～Actinase E滅活；

S4，將步驟S3中獲得的產物用蛋白酶K或堿性蛋白酶～alcalase在53～56℃溫度下處理6～24小時以進一步降解所述蛋清中殘余的蛋白質以及滅活的鏈霉蛋白酶～Actinase E；

S5，將步驟S4中的蛋白酶K或堿性蛋白酶～alcalase滅活；

S6，將步驟S5所獲得的產物離心分離，獲取上清液；

S7，從步驟S6獲得的上清液中提取總糖胺聚糖；

S8，將從步驟S7獲得的總糖胺聚糖溶解于水，然后加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III于37℃反應2～16小時以降解總糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素，然后加入硫酸軟骨素酶反應液以及硫酸軟骨素酶III、硫酸軟骨素酶II于37℃反應8～24小時以降解總糖胺聚糖中的硫酸軟骨素/硫酸皮膚素以及透明質酸；

S9，將從步驟S8獲得的產物加入強效陰離子交換柱，或往產物中加入強堿性陰離子交換樹脂結合過夜，上清液與樹脂體積比為5～80：1；之后用0.1～0.5M的NaCl洗滌所述強效陰離子交換柱或所述強堿性陰離子交換樹脂以去除結合不緊密的酶解后的糖鏈碎片或其它雜質，再用3.3M的NaCl洗脫獲得硫酸角質素鹽溶液；隨后，或者用截留量為3～10kDa的超濾管或透析袋脫鹽去除NaCl獲得硫酸角質素；或者先用2～5倍體積的甲醇加入硫酸角質素鹽溶液，在-20～8℃沉淀12～18小時，離心，棄含鹽上清，之后用體積濃度70～95v％甲醇洗滌硫酸角質素沉淀；最后凍干或空干獲得最終產物硫酸角質素。

2.根據權利要求1所述的蛋清中硫酸角質素的提取方法，其特征在于，步驟S2中，所述鏈霉蛋白酶～Actinase E與直接從蛋中分離的液態蛋清的質量比1:50～300。

3.根據權利要求1所述的蛋清中硫酸角質素的提取方法，其特征在于，步驟S2中，冷凍干燥的蛋清或烘干后粉碎的蛋清，先用水或磷酸鹽緩沖液PBS溶解，水或PBS與干燥蛋清的質量比為10～50：1，之后加入鏈霉蛋白酶～Actinase E，酶與干燥蛋清的質量比1：20～100。

4.根據權利要求1所述的蛋清中硫酸角質素的提取方法，其特征在于，將步驟S2中的鏈霉蛋白酶～Actinase E滅活包括：將步驟S2獲得的產物在90～95℃加熱處理10～30分鐘。

5.根據權利要求1所述的蛋清中硫酸角質素的提取方法，其特征在于，步驟S4中，所述蛋白酶K與鏈霉蛋白酶～Actinase E的質量比1：5～15，所述堿性蛋白酶～alcalase與鏈霉蛋白酶～Actinase E的質量比1：5～20。

6.根據權利要求1所述的蛋清中硫酸角質素的提取方法，其特征在于，將步驟S4中的蛋白酶K或堿性蛋白酶～alcalase滅活包括：將步驟S4獲得的產物在90～100℃加熱處理10～40分鐘。

7.根據權利要求1所述的蛋清中硫酸角質素的提取方法，其特征在于，在步驟S6中，所述將步驟S5所獲得的產物離心分離，通過懸浮桶轉子3200～8000xg離心力實現。

8.根據權利要求1所述的蛋清中硫酸角質素的提取方法，其特征在于，步驟S7包括：將所述上清液加入強效陰離子交換柱，或往所述上清液中加入強堿性陰離子交換樹脂結合過夜，上清液與樹脂體積比為5～80：1；之后用0.1～0.5M的NaCl洗滌所述強效陰離子交換柱或所述強堿性陰離子交換樹脂以充分洗掉雜蛋白或其它雜質，隨后用3.3M的NaCl洗脫獲得總糖胺聚糖鹽溶液；之后，或者用截留量為3～10kDa的超濾管或透析袋去除NaCl獲得總糖胺聚糖；或者先用2～5倍體積的甲醇加入總糖胺聚糖鹽溶液，在-20～8℃溫度下沉淀總糖胺聚糖12～18小時，然后離心去除含鹽上清，之后用體積濃度95％甲醇連續多次洗滌總糖胺聚糖沉淀；將所述總糖胺聚糖產物凍干或空干。