[發明專利]一種檢測鮮煙葉中多種類黃酮代謝組學方法

有效

• 申請號: 201610267800.9
• 申請日: 2016-04-27
• 公開（公告）號: CN105699579B
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 金立鋒;趙明月;胡賁;周會娜;許國旺;劉萍萍;鄭慶霞;陳千思;陳霞;翟妞;王燃;李鋒;武明珠;林福呈
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06;G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明涉及煙草中類黃酮類檢測，具體是一種檢測鮮煙葉中多種類黃酮代謝組學方法，包括蘆丁、槲皮素、柚皮素、山奈酚苷、紫云英苷、柚皮苷、異甘草素七種類黃酮化合物的同時定量檢測，可用于植物類黃酮類物質代謝途徑及基因功能研究。

背景技術

類黃酮是一類重要的植物天然產物，在植物體內扮演諸多功能，比如色素，轉運因子和信號分子等，同時在植物對抗生物和非生物脅迫時候起到重要作用。近年來，類黃酮受到越來越廣泛的關注，其中一個原因是植物類黃酮提取物可以在體外起到重要的保健作用，比如降低心臟病和癌癥等的風險。這些性質可能和類黃酮的抗氧化性相關。

類黃酮是煙草中一類低分子量多酚類次生代謝物，與煙葉色澤及品質有關，可以保護煙草抵御外界的生物及非生物脅迫，在煙草生長發育過程中具有重要作用，同時還是煙草中一類重要香氣前體物，其在煙葉調制過程中可以與煙葉中氨基酸或蛋白質通過棕色化反應形成棕色或褐色物質，影響煙葉外觀品質，在煙葉醇化和燃燒過程中可以產生對煙草香氣有直接影響的二元酚類醛類衍生物，提升煙葉香氣品質。另外，由于類黃酮類物質的生物活性及煙草高生物學產量的特性，以煙草作為生物反應器生產具有生物活性的類黃酮藥物是煙草未來的重要應用方向。

國內外關于煙草類黃酮物質的分離、鑒定及檢測取得了一定進展，但是仍然滯后于研究需求及生產實踐。目前，尚缺乏對于煙草主要類黃酮物質進行全面檢測分析的方法體系，目前針對煙草類黃酮的檢測最常用的方法是比色法和色譜法，比色法用時少，成本低，但是由于煙草成分復雜，會有其他物質對比色結果相互干擾，所以結果準確度不高。目前國內外廣泛開展的煙草基因組學及代謝組學研究需要對煙葉中多種類黃酮類物質進行精確檢測，以期闡明煙草類黃酮物質的代謝規律及調控機制。因此，目前基礎研究及生產實踐都亟需建立煙草類黃酮類物質檢測分析方法。

發明內容

本發明的目的旨在提供一種具備準確且能夠同時檢測煙草鮮葉片內七種重要類黃酮（蘆丁、槲皮素、山奈酚苷、紫云英苷、柚皮苷、柚皮素、異甘草素）的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種檢測鮮煙葉中多種類黃酮代謝組學方法，采用超聲萃取法提取煙葉中的類黃酮成分，通過UPLC-QqQ-MS/MS實現新鮮煙葉中蘆丁、槲皮素、柚皮素、山奈酚苷、紫云英苷、柚皮苷、異甘草素的檢測，具體步驟如下：

（1）將新鮮煙葉凍干粉末，用濃度60%-90%甲醇混勻，20℃-30℃超聲水浴20min；離心棄沉淀，經0.22μm有機膜過濾后儲存備用，作為待測樣品；新鮮煙葉凍干粉末與濃度80%甲醇的比例為質量體積比1∶50-100，單位g/ml。

（2）配制上述七種物質的標準工作溶液；

標準工作溶液為七種物質的混合標準溶液，其中蘆丁的質量濃度為0.01, 0.1, 1, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 400 mg/L ，其他標準溶液濃度為0.01, 0.1, 1, 20, 40, 60, 80, 100 mg/L，其中200mg/l、400 mg/l濃度的標準溶液只含蘆丁和內標。

（3）采用UPLC-QqQ-MS/MS對加入內標的標準工作溶液和加入內標的待測樣品溶液進行檢測，所述內標為木荊黃素；所述內標由萃取液甲醇配制，內標溶液的終濃度為12mg/mL。

（4）色譜與質譜條件如下：

色譜條件：色譜柱為zorbax sb-c18 column，規格為 100 mm × 2.1 mm×1.8 m；流動相為A相為水/甲酸，體積比99.9:0.1；B相為乙腈/甲酸，體積比99.9:0.1；流速維持在0.3 mL/min，柱溫30℃，梯度洗脫：0～2.0 min，5％ B；2．0～10.0 min，5％ B→25％B；10.0～12.0 min，25％B→95％B；12.0～15.0min，95％B，進樣量3μL；

質譜條件：氮氣溫度 350℃，干燥氣流速11 L/min，毛細管電壓3.0 kV，霧化氣壓45 psi. MRM模式下掃描的離子對分別是：蘆丁 m/z 611.2→303.1、槲皮素 m/z 303.1→152.9、山奈酚苷 m/z 595.2→287.0、紫云英苷 m/z 449.1→287.0、柚皮苷 m/z 581.2→273.1、柚皮素 m/z 273.1→153.1、異甘草素m/z 257.1→137.1、木荊黃素 m/z 433.1→313.1；