[發(fā)明專利]一種TALE重復(fù)序列載體的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610266044.8
• 申請(qǐng)日: 2016-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN107312788B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王崧;胡寶洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

本發(fā)明提供了一種構(gòu)建TALE重復(fù)序列載體的方法，其特征在于，所述方法包括：1)以含有TALE二聚體的核苷酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)以BsaI酶切步驟1)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，將所述酶切獲得的含TALE的片段連接形成TALEN重復(fù)序列載體。本發(fā)明操作更加簡單，需要的載體數(shù)量和工作量更少，并且能夠通過PCR的方式進(jìn)行擴(kuò)增，大大提高了工作效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種快速、高效構(gòu)建TALE重復(fù)序列載體的方法。

背景技術(shù)

對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行定向修飾是科研工作者長久以來的夢(mèng)想。雖然鋅指核酸酶(zinc finger nuclease)的出現(xiàn)大大促進(jìn)了基因組編輯領(lǐng)域的發(fā)展，但是篩選出能高效、特異結(jié)合特定DNA序列的鋅指蛋白是非常困難的技術(shù)難題，并且這項(xiàng)技術(shù)耗時(shí)、費(fèi)力、成本較高。來自于植物病原體Xanthomonas的類轉(zhuǎn)錄激活因子(transcription activator-likeeffector，TALE)能夠特異地識(shí)別特定的DNA序列。研究表明，TALE的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域主要由1到33個(gè)長度為33-35個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)單元串聯(lián)后，再加上末尾的一個(gè)含有20個(gè)氨基酸殘基的半重復(fù)單位構(gòu)成。在單個(gè)重復(fù)單元中，第12、13位氨基酸殘基決定了TALE識(shí)別DNA的特異性，被稱為重復(fù)可變二殘基(repeat variable di-residue，簡稱RVD)位點(diǎn)；其它位點(diǎn)的氨基酸殘基則高度保守。不同的RVD能夠分別特異識(shí)別A、T、C、G四種堿基(Boch et al.,2009)。由于TALE蛋白識(shí)別DNA是基于一種氨基酸：核苷酸特異對(duì)應(yīng)識(shí)別的模式，可以預(yù)期其在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究、臨床治療及藥物研發(fā)，以及農(nóng)林牧漁業(yè)經(jīng)濟(jì)物種遺傳改造等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。將TALE的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其它功能性的結(jié)構(gòu)域融合后，可以得到各種衍生的融合蛋白，由此，在理論上能對(duì)基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行多種不同的特定修飾。比如，與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合后，能夠特異增強(qiáng)靶基因的表達(dá)(Zhang et al.,2011a)；與組蛋白去甲基化酶融合后，可以改變特定基因座(genome locus)的表觀遺傳狀態(tài)(Mendenhallet al.,2013)；與FokI核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域融合形成的蛋白稱為TALE核酸酶(TALEnuclease，簡稱TALEN)，能夠?qū)蚪M的特定靶位點(diǎn)進(jìn)行定向切割，從而實(shí)現(xiàn)基因打靶(Miller et al.,2011)。目前，TALE技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因組修飾領(lǐng)域，而關(guān)鍵步驟是要構(gòu)建識(shí)別特異DNA序列的TALE載體。為保證TALE蛋白識(shí)別的特異性并減少脫靶效應(yīng)，人工合成的TALE蛋白通常含有15個(gè)以上的重復(fù)單元。由于TALE序列的高度保守性，TALE串聯(lián)重復(fù)序列的構(gòu)建不能用常規(guī)的分子克隆方法來完成，這 成為TALE應(yīng)用的最大障礙。目前，構(gòu)建TALE串聯(lián)重復(fù)序列的主要方法包括人工合成全長的TALE序列，基于Golden Gate的載體克隆技術(shù)，基于同尾酶的載體克隆技術(shù)，基于T4DNA聚合酶的不依賴連接酶(ligation-independent cloning,LIC)的載體克隆技術(shù)，以及基于USER酶的ULtiMATE技術(shù)。GoldenGate技術(shù)主要利用IIS類限制性內(nèi)切酶的特性：識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不在同一位置；因此，當(dāng)把含有切割位點(diǎn)的接頭加在5’和3’端時(shí)，通過酶切反應(yīng)產(chǎn)生的黏性末端如果互補(bǔ)，就可以通過連接反應(yīng)將這些DNA片段連接在一起，并且正確連接的片段將不再有對(duì)應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。未連接的產(chǎn)物由于具有識(shí)別位點(diǎn)會(huì)再次被切割，最終正確連接的產(chǎn)物越來越多。基于這種方法的TALE載體構(gòu)建已經(jīng)廣泛報(bào)道(Cermak et al.,2011；Zhang et al.,2011b)。基于同尾酶的TALE構(gòu)建原理如下：其采用了“替代重復(fù)單元”(或稱“旁重復(fù)單元”,alternativerepeat unit),從而能夠利用氨基酸密碼的簡并性在這種重復(fù)單元的兩端設(shè)計(jì)一對(duì)同尾酶(5′端SpeⅠ和3′端NheⅠ)的酶切位點(diǎn)，再加上一個(gè)輔助性的HindⅢ位點(diǎn),這樣就可以用相同的酶切策略、通過酶切-連接的循環(huán)操作構(gòu)建任意長度的重復(fù)序列(Huang etal.,2011)。基于T4DNA聚合酶的不依賴連接酶(ligation-independent cloning,LIC)的TALE構(gòu)建原理如下：在只有一種dNTP情況下利用T4DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性產(chǎn)生固定長度的互補(bǔ)尾部。該酶以3’-5’方向切除核苷酸直至其遇到與反應(yīng)混合物中加入的那種dNTP相同的核苷酸。此時(shí)，由于dNTP的摻入，T4DNA聚合酶的聚合酶活性取代了核酸外切酶活性。由于這些互補(bǔ)尾部較長，因此不需要額外的DNA連接酶就可以被連接起來(Schmid-Burgk et al.,2013)。ULtiMATE原理如下：這種方法需要先構(gòu)建3個(gè)單體所有可能組和的載體庫，然后利用USER酶特異識(shí)別并切割脫氧尿嘧啶核苷酸殘基(dU)的特性，使DNA片段產(chǎn)生獨(dú)特的單鏈DNA突出末端，從而達(dá)到組裝TALE的目的(Yang et al.,2013)。